La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

Estudio del Genotipo del Síndrome de Gilbert por reversión con cebador, Polimorfismo de UGT1A1 (TA) n Promotor con Fusión de Alta Resolución J.S. Farrar,

Presentaciones similares


Presentación del tema: "Estudio del Genotipo del Síndrome de Gilbert por reversión con cebador, Polimorfismo de UGT1A1 (TA) n Promotor con Fusión de Alta Resolución J.S. Farrar,"— Transcripción de la presentación:

1 Estudio del Genotipo del Síndrome de Gilbert por reversión con cebador, Polimorfismo de UGT1A1 (TA) n Promotor con Fusión de Alta Resolución J.S. Farrar, R.A. Palais y C.T. Wittwer Septiembre 2011 © Copyright 2011 by the American Association for Clinical Chemistry

2 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción Síndrome de Gilbert Una hiperbilirrubinemia hemolítica no conjugada crónica Asociada con inserciones de timina- adenina (TA) en el promotor UGT1A1 El genotipo promotor UGT1A1 también está correlacionado con toxicidad inducida por la droga terapéutica irinotecan

3 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción Polimorfismo del UGT1A1 (TA) n promotor Variaciones en longitud en las repeticiones: (TA) 5, (TA) 6, (TA) 7, (TA) 8 La frecuencia y longitud de repeticiones depende de la etnicidad. Los alelos (TA) 5 y (TA) 8 están restringidos a descendientes de africanos. Métodos actuales para determinar el genotipo Pasos manuales múltiples, sondas múltiples etiquetadas y/o dificultan el análisis del enotipo de los alelos (TA) 5 y (TA) 8

4 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción (cont) Estudio del genotipo por reversión con cebador Método de fusión de alta resolución, tubo cerrado Usa un colorante de ADN saturado de doble espiral en lugar de los cebadores/sondas modificados covalentemente Solo se requieren dos cebadores estándar de PCR (uno con una adición de 5) Previamente se han aplicado a variantes de base simple y pequeñas delaciones

5 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta ¿Porqué es importante que los ensayos de tipificación de UGT1A1 (TA) n sean validados para la repetición de los alelos (TA) 5 y (TA) 8 ?

6 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Alcance de la reversión por cebador para el genotipo promotor de polimorfismo de UGT1A1 (TA) n. A una sonda complementaria a la repetición de (TA) 5 se le adicionan 5 al cebador de PCR previo (gris). PCR asimétrico sobre produce un producto de ADN de cadena sencilla que forma una horquilla intramolecular. Los productos con repeticiones mayores de (TA) 5 forman lazos protuberantes que progresivamente desestabilizan la estructura de horquilla. La estabilidad de la horquilla (Hairpin Stability) se revela por análisis de fusión de alta resolución. Materiales y Métodos

7 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y Métodos(cont) 100 muestras de ADN de afroamericanos Población de estudio enriquecida para los alelos (TA) 5 y (TA) 8 Nuevo método de análisis de fusión Localiza la desviación específica de la decaída exponencial de manera que pueda removerse la fluorescencia de respaldo Mejora la agrupación de genotipos

8 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y Métodos(cont) 3 métodos diferentes de obtención del genotipo Análisis fragmentario (método de referencia) Fusión de pequeña ampliación Estudio del genotipo de reversión con cebador 2 estudios bloqueados Estudio del genotipo por fusión de pequeña ampliación y reversión con cebador en un instrumento basado en capilaridad. Comparación instrumental para el estudio del genotipo de reversión con cebador (capilaridad vs. placa)

9 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta ¿Qué estructura forma una reversión por cebador después de PCR y cómo revela esta estructura la repetición del genotipo (TA) n ?

10 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Resultados Estudio del genotipo de reversión con cebador en un instrumento por capilaridad 99% son concordantes con los resultados del genotipo por análisis fragmentario Un re análisis de la única muestra discordante reveló un error en el análisis fragmentario 100% de precisión después de la corrección del error en el fragmento

11 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Resultados (cont) Estudio del genotipo de reversión con cebador en un instrumento por capilaridad Aún cuando las diferencias de temperatura de fusión son pequeñas, la precisión de la temperatura absoluta del instrumento y los trazos de las curvas de fusión permiten el estudio del genotipo

12 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Resultados (cont) Genotipo Actualn Genotipo mal clasificadon (TA) 5 /(TA) 6 6 ­ (TA) 5 /(TA) 7 7(TA) 5 /(TA)61 (TA) 5 /(TA) 8 2 ­ (TA) 6 /(TA) 6 22(TA) 5 /(TA)61 (TA) 6 /(TA) 7 34(TA)6/(TA)64 (TA)7/(TA)71 (TA) 6 /(TA) 8 7(TA)6/(TA)73 (TA)7/(TA)71 (TA)7/(TA)81 (TA) 7 /(TA) 7 15(TA) 6 /(TA) 7 1 (TA) 7 /(TA) 8 7(TA) 7 /(TA) 7 3 Total Estudio del genotipo de pequeña ampliación en un instrumento por capilaridad 84% de precisión comparada con el análisis fragmentario después de la corrección del error

13 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Resultados (cont) Genotipo actualnGenotipo mal clasificadon (TA) 5 /(TA) 6 5­­0 (TA) 5 /(TA) 7 6(TA)6/(TA)72 (TA) 5 /(TA) 8 2(TA) 5 /(TA)71 (TA) 6 /(TA) 6 21(TA)5/(TA)71 (TA)6/(TA)71 33(TA)7/(TA)73 (TA) 6 /(TA) 8 7(TA) 6 /(TA) 7 1 (TA) 7 /(TA) (TA) 6 /(TA) 8 3 (TA) 7 /(TA) 8 3 6­­0 Total95 18 Estudio del genotipo por reversión con cebador en un instrumento de placa 100% de precisión en el instrumento por capilaridad cae al 81% en un instrumento de placa

14 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta ¿Porqué depende la precisión del genotipo del instrumento?

15 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Conclusiones El instrumento y método para estudiar el genotipo son críticos para tener éxito El resultado del instrumento de fusión de alta resolución de placa no fue tan bueno como el de capilaridad La precisión de temperatura absoluta del instrumento es crítica El desempeño de del genotipo por reversión con cebador fue mejor que la de pequeña ampliación Los cebadores de reversión pueden ser usados para repeticiones de genotipo de secuencia simple en <30 min

16 © Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Gracias por participar en el Journal Club de Clinical Chemistry de este mes Otros Journal Clubs están disponibles en rac Síganos en


Descargar ppt "Estudio del Genotipo del Síndrome de Gilbert por reversión con cebador, Polimorfismo de UGT1A1 (TA) n Promotor con Fusión de Alta Resolución J.S. Farrar,"

Presentaciones similares


Anuncios Google