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TECNICAS GENÉTICAS. Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo.

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Presentación del tema: "TECNICAS GENÉTICAS. Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo."— Transcripción de la presentación:

1 TECNICAS GENÉTICAS

2 Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales Cuantificación del número de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vírica) Cuantificación del número de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vírica) Detección de factores de virulencia Detección de factores de virulencia Determinación de resistencia a antibióticos directamente en muestra o sobre cultivo Determinación de resistencia a antibióticos directamente en muestra o sobre cultivo Estudios epidemiológicos: comparación cepas aisladas Estudios epidemiológicos: comparación cepas aisladas

3 TÉCNICASTÉCNICAS Muchas. Variantes de las preexistentes o nuevas Muchas. Variantes de las preexistentes o nuevas Clasificación: Clasificación: Técnicas de hibridación Técnicas de hibridación Técnicas de amplificación Técnicas de amplificación

4 PREMISASPREMISAS Primer paso: extracción de los ácidos nucleicos Primer paso: extracción de los ácidos nucleicos Lisis celular Lisis celular Concentración del ácido nucleico Concentración del ácido nucleico Protección frente a la degradación enzimática Protección frente a la degradación enzimática Eliminación de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizar Eliminación de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizar Métodos Métodos Físicos: sonicación, congelación/descongelación… Físicos: sonicación, congelación/descongelación… Químicos: Químicos: Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidina…Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidina… Enzimáticos: lisozima… Enzimáticos: lisozima…

5 PREMISASPREMISAS Desnaturalización: cuando se calienta ADN por enciam de 90ºC las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original Desnaturalización: cuando se calienta ADN por enciam de 90ºC las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso el que queremos detectar Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso el que queremos detectar

6 HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN Unión de la sonda con su secuencia complementaria. Muy específica Unión de la sonda con su secuencia complementaria. Muy específica Detección: sondas marcadas Detección: sondas marcadas Sustancia radiactiva Sustancia radiactiva Fluorescente Fluorescente Enzima Enzima Acs marcadas frente a ADN bicatenario Acs marcadas frente a ADN bicatenario …

7 HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN

8 HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN Formatos Formatos En solución En solución Soporte o fase sólida Soporte o fase sólida INNO-LIPAINNO-LIPA In situ In situ

9 HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN

10 HIBRIDACIÓN Sustrato Sustrato coloreado Hibridación Sonda ADN complementario Soporte

11 TECNOLOGÍA DE LOS CHIPS O DE LOS ARRAYS

12 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

13 Hibridación directa: baja sensibilidad Hibridación directa: baja sensibilidad Paso previo: amplificación Paso previo: amplificación Clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de: Clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de: ADN ADN ARN: tras conversión en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa ARN: tras conversión en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa

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15 TÉCNICASTÉCNICAS PCR PCR Nested-PCR Nested-PCR PCR múltiple PCR múltiple PCR cuantitativa PCR cuantitativa PCR a tiempo real PCR a tiempo real Amplificación basada en la transcripción Amplificación basada en la transcripción Otras técnicas que no amplifican una secuencia diana Otras técnicas que no amplifican una secuencia diana

16 PCRPCR Se amplifica una secuencia diana espedífica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperatura Se amplifica una secuencia diana espedífica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperatura

17 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Elementos químicos Elementos químicos ADN problema ADN problema Primers o iniciadores Primers o iniciadores dNTPs dNTPs Polimerasa Polimerasa Iones.... Iones.... Elementos físicos Elementos físicos Temperatura Temperatura DesnaturalixaciónDesnaturalixación ApareamientoApareamiento Síntesis o extensiónSíntesis o extensión ADN? Iniciadores Polimerasa dNTPs Iones...

18 Desnaturalización Apareamiento Extensión

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20 NESTED-PCRNESTED-PCR Amplificación de un fragmento Amplificación de un fragmento Reamplificación de un fragmento interno con otros cebadores Reamplificación de un fragmento interno con otros cebadores En 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubos En 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubos

21 PCR MÚLTIPLE Muestra extraida + varios juegos de cebadores Muestra extraida + varios juegos de cebadores Amplificación de diferentes dianas Ej.: identificación + determinantes de resistencia

22 PCR CUANTITATIVA Determinar el número de copias de la muestra inicial Determinar el número de copias de la muestra inicial Suele utilizarse una técnica competitiva Suele utilizarse una técnica competitiva ADN ó ARN problema ADN ó ARN competidor Cantidad conocida + Mismos cebadores Mismos cebadores Igual longitud amplificados Igual longitud amplificados Mismas condiciones Mismas condiciones Cantidad Ci Cf = Ci Cf Relación lineal

23 PCR A TIEMPO REAL Realización en muy poco tiempo (aprox. 30´) Realización en muy poco tiempo (aprox. 30´) Cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando Cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando Igual que PCR convencional pero modificaciones técnicas Capilar: cambios de temperatura muy rápidos Capilar: cambios de temperatura muy rápidos Fragméntos amplificados muy cortos Fragméntos amplificados muy cortos Termociclador y lector específicos Termociclador y lector específicos Diferentes métodos de detección Diferentes métodos de detección

24 AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA TRANSCRIPCIÓN Variedades: NASBA, TMA, 3SR… Variedades: NASBA, TMA, 3SR… OTRAS TÉCNICAS QUE NO AMPLIFICAN SECUENCIAS DIANA Amplificación de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianas Amplificación de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianas LCR (Ligase Chain Reaction) LCR (Ligase Chain Reaction) Ligar y amplificar los cebadores Ligar y amplificar los cebadores Q -replicasa: no comercializada Q -replicasa: no comercializada

25 REACCIONES ANTÍGENO/ANTICUERPO Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción Ag-Ac ha tenido lugar Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción Ag-Ac ha tenido lugar Base fundamental: especificidad de la reacción Base fundamental: especificidad de la reacción ?Conocido + Dco directo ? Conocido + Dco indirecto


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