TECNICAS GENÉTICAS.

Presentación del tema: "TECNICAS GENÉTICAS."— Transcripción de la presentación:

1 TECNICAS GENÉTICAS

2 Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales Cuantificación del número de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vírica) Detección de factores de virulencia Determinación de resistencia a antibióticos directamente en muestra o sobre cultivo Estudios epidemiológicos: comparación cepas aisladas

3 TÉCNICAS Muchas. Variantes de las preexistentes o nuevas
Clasificación: Técnicas de hibridación Técnicas de amplificación

4 PREMISAS Primer paso: extracción de los ácidos nucleicos Métodos
Lisis celular Concentración del ácido nucleico Protección frente a la degradación enzimática Eliminación de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizar Métodos Físicos: sonicación, congelación/descongelación… Químicos: Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidina… Enzimáticos: lisozima…

5 PREMISAS Desnaturalización: cuando se calienta ADN por enciam de 90ºC las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso el que queremos detectar

6 HIBRIDACIÓN Unión de la sonda con su secuencia complementaria. Muy específica Detección: sondas marcadas Sustancia radiactiva Fluorescente Enzima Acs marcadas frente a ADN bicatenario …

7 HIBRIDACIÓN

8 Formatos HIBRIDACIÓN En solución Soporte o fase sólida In situ
INNO-LIPA In situ

9 HIBRIDACIÓN

10 HIBRIDACIÓN ADN complementario Sonda Soporte Hibridación Sustrato
Sustrato coloreado

11 TECNOLOGÍA DE LOS CHIPS O DE LOS “ARRAYS”

12 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

13 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
Hibridación directa: baja sensibilidad Paso previo: amplificación Clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de: ADN ARN: tras conversión en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa

14

15 TÉCNICAS PCR Nested-PCR PCR múltiple PCR cuantitativa
PCR a tiempo real Amplificación basada en la transcripción Otras técnicas que no amplifican una secuencia diana

16 PCR Se amplifica una secuencia diana espedífica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperatura

17 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Elementos químicos ADN problema Primers o iniciadores dNTPs Polimerasa Iones.... Elementos físicos Temperatura Desnaturalixación Apareamiento Síntesis o extensión ADN? Iniciadores Polimerasa dNTPs Iones...

18 Desnaturalización Apareamiento Extensión

19

20 NESTED-PCR Amplificación de un fragmento
Reamplificación de un fragmento interno con otros cebadores En 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubos

21 PCR MÚLTIPLE Muestra extraida + varios juegos de cebadores
Amplificación de diferentes dianas Ej.: identificación + determinantes de resistencia

22 PCR CUANTITATIVA Determinar el número de copias de la muestra inicial Suele utilizarse una técnica competitiva Cantidad conocida ADN ó ARN problema ADN ó ARN competidor + Mismos cebadores Igual longitud amplificados Mismas condiciones Cantidad Cantidad Ci Ci = Relación lineal Cf Cf

23 PCR A TIEMPO REAL Realización en muy poco tiempo (aprox. 30´)
Cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando Igual que PCR convencional pero modificaciones técnicas Capilar: cambios de temperatura muy rápidos Fragméntos amplificados muy cortos Termociclador y lector específicos Diferentes métodos de detección

24 AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA TRANSCRIPCIÓN
Variedades: NASBA, TMA, 3SR… OTRAS TÉCNICAS QUE NO AMPLIFICAN SECUENCIAS DIANA Amplificación de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianas LCR (Ligase Chain Reaction) Ligar y amplificar los cebadores Q-replicasa: no comercializada

25 REACCIONES ANTÍGENO/ANTICUERPO
Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción Ag-Ac ha tenido lugar Base fundamental: especificidad de la reacción + Dco directo ? Conocido ? Conocido + Dco indirecto