WESTERN BLOT CRUZ GUTIÉRREZ BRENDA GUADALUPE

WESTERN BLOT  ElWesternblot,o inmunoblot,esuna técnicaanalíticausada paradetectarproteínas enunaespecíficas muestra Mediante electroforesis determinada. una engelse separan las proteínas.  Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente.

ELECTROFORESIS Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo eléctrico a una solución que contenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que dependerá de su carga neta, forma y peso molecular. Esta técnica es conocida como electroforesis.

TIPOS Directo El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.

Indirecto El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se una al primario y reacciona con el sustrato.

PROCEDIMIENTO

SECUENCIA DEL WESTERN BLOT Electroforesis de la muestra con las proteinas Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosa Incubacion con el anticuerpo especifico primario Lavados del anticuerpo no unido Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano (HRP) Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas

APLICACIONES

DIAGNÓSTICO  Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra.  También nos puede ser útil para determinar los niveles de dicha proteína en esa muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en determinadas enfermedades el problema no es la ausencia total de una molécula sino su reducción o la expresión de una forma truncada de dicha proteína.

 Prueba de VIH  Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja. DIAGNÓSTICO

 Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".  Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.  En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.

 Con ella se pueden determinar los niveles de una proteína antes y después de un tratamiento, su nivel de fosforilación u otras modificaciones post-traduccionales, etc.

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