Ensayo Western blot.

Presentación del tema: "Ensayo Western blot."— Transcripción de la presentación:

1 Ensayo Western blot

2 Electroforesis Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

3 Técnicas Northern blot: separación de moléculas de ARN transferencia a una matriz se fija Southern blot: separación de moléculas de ADN transferencia a una matriz se fija Western blot: separación de proteínas transferencia a una matriz se adhiere anticuerpo específico se fija

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5 Procedimiento General
A) Cultivo tisular B) Lisado celular y obtención de proteínas. C) Electroforesis en gel de poliacrilamida . D) Transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa. E) Incubación del papel con suero del paciente. F) Si existen anticuerpos para el Antígeno en el suero, éstos se unirán fuertemente a las proteínas transferidas al papel y se detectarán como bandas oscuras (f).

6 The transfer of protein from the gel is achieved by applying an electric potential across the gel and the membrane, which are in contact. The membrane, nitrocellulose, polyvinylidene difluoride (PVDF), or Nylon, provides a more stable matrix than the gel, making subsequent manipulations much easier. In tank systems, an arrangement of sponge pad, filter paper, gel, membrane, filter paper, and sponge pad soaked in transfer buffer are held together, in that order, by a ridge plastic cassette. 

7 Procedimiento General
Los anticuerpos primarios pueden detectarse a través de dos métodos: 1) Usando proteína A o proteína G 2) Con la participación de un segundo anticuerpo

8 Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aislan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.

9 Anticuerpos secundarios:
-Anticuerpos anti-anticuerpos -Anticuerpos monoclonales -Fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros

10 Ensayo de transferencia Western para VIH
HIV BLOT 2.2

11 Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detección in vitro de anticuerpos frente a los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o plasma humanos. Es más especifico para la detección de VIH en plasma o suero.

12 Se utiliza electroforesis y electrotransferencia para la adhesión de antígeno vírico del VIH-1.
Péptido sintético específico contra VIH-2. Control interno para reducir el riesgo de falsos negativos.

13 Principios quimicos y biologicos
Tiras de nitrocelulosa+VIH1+VIH2 Incubación en control y diluidos Si presentan anticuerpos frente VIH1 y VIH2 Se observa la union de estos a los antigenos y proteinas Lavado Reacciones con anticuerpos de cabra anti IgG humana Deteccion de cantidades ínfimas de anticuerpos.

14 Componentes del kit Tiras de nitrocelulosa Control no reactivo
Control reactivo fuerte Control reactivo debil Tampón de blotting concentrado (10x) Tampon de lavado concentrado (20X) Conjugado Sustrato Polvo de blotting

15 Control de Calidad Debe cumplir con las siguientes condiciones:
Control no reactivo: no bandas específicas de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser visible. Control reactivo fuerte: todas las bandas de peso molecular que corresponda deben ser visibles. Control reactivo débil: medida de sensibilidad del kit. Las bandas del control de suero deben ser visibles.

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17 Interpretación de los resultados
Tiras deben estar completamente secas. Se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tira de control de ensayo con los controles No reactivo, Reactivo Fuerte y Reactivo Débil. Algunos antígenos derivan de las mismas proteínas precursoras y pueden tener epitopos superpuestos.

18 Verificar que la banda de control del suero sea visible
Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira de analisis utilizando como guia las tiras de control reactivo Fuerte, Debil o ambos. Interpretacion de las tiras de analisis según las autoridades pertinentes.

19 PMENV GEN Antígeno Descripción Gp 160 ENV Forma polimerica de la gp41 Ancha y difusa de glucoproteina Gp 120 Membrana externa Difusa de glucoproteina p66 POL Transcriptasa inversa Banda discreta p55 GAG Proteina precursora p51 Banda discreta justo por debajo de p55 p39 Fragmento de p55 gp41 Transmembrana p31 Endonucleasa Doblete p24 Proteína central (core) Banda ancha p17

20 Todas las bandas deben ser detectadas e interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso.
Patron Interpretacion Ninguna banda virica especifica presente Negativo Deteccion de anticuerpos p17 unicamente Deteccion de dos ENV y GAG o POL VIH-1 positivo Deteccion de dos ENV y GAG o POL y banda especifica de VIH-2 visible VIH-1 positivo con VIH-2 señalado Cualquier banda virica especifica presente, pero el patro no cumple con los patrones de positivo Dudoso Cualquier banda virica especifica presente ,pero el patron no cumple los criterios para positivo con una banda especifica de IH-2 visible Dudoso con VIH-2 señalado

21 On the left side of the image there are two columns to be used as points of comparison. The column marked "NC" is an HIV-negative test result and the column marked "PC" is an HIV-positive test result. Columns 3 to 10 show a series of tests on an individual person who became infected with HIV to illustrate how an HIV test result can change during the window period from HIV-negative to HIV-positive. Each column is one Western Blot test. These tests were performed on a single person beginning with the day the person was first infected with HIV (Column 3, Day 0) to when the person had a conclusive HIV infection (Column 10, Day 30). Each black or dark grey horizontal stripe is representative of the presence of a different antibody against a protein found in HIV. To be conclusive (HIV-positive), a Western Blot must have 5 horizontal stripes.