Aplicaciones diagnósticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A. Una muestra clínica (p. ej., pus, tejido) contiene DNA de muchas fuentes.

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1 Aplicaciones diagnósticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A. Una muestra clínica (p. ej., pus, tejido) contiene DNA de muchas fuentes así como el cromosoma del organismo de interés. Si se separan las cadenas de DNA (desnaturalizan), los cebadores de la PCR pueden enlazarse con sus secuencias blanco en el espécimen mismo. B. Amplificación de la secuencia blanco por medio de PCR. 1) Se muestra la secuencia blanco en su estado natural. 2) Se desnaturaliza el DNA, lo que permite que los cebadores se unan donde encuentren la secuencia homóloga. 3) En presencia de la DNA polimerasa especial se sintetiza DNA nuevo a partir de ambas hebras en la región entre los cebadores. 4-6) Se añaden ciclos adicionales mediante el control de la temperatura de la polimerasa y cada nueva secuencia actúa como plantilla para otra. El DNA se duplica con cada ciclo. Después de 25 a 30 ciclos hay suficiente DNA presente para realizar un análisis diagnóstico. C. Sonda interna. Se muestra la secuencia blanco amplificada. Es posible diseñar una sonda que se enlace a una secuencia localizada entre (al interior de) los cebadores. D. Análisis del DNA amplificado por PCR. 1) La secuencia amplificada puede clonarse en un plásmido vector. De esta manera pueden llevarse a cabo diversas manipulaciones o secuenciaciones moleculares. 2) Las hibridaciones directas normalmente hacen uso de una sonda interna. El ejemplo muestra tres especímenes, cada uno de los cuales transitó por los pasos A y B. Después de su amplificación, cada uno se enlazó con un punto separado en un filtro (transferencia por puntos [dot blot]). Más adelante se hace reaccionar al filtro con la sonda interna a fin de detectar el DNA amplificado por PCR. El resultado muestra que sólo el espécimen central contenía la secuencia meta. 3) El DNA amplificado puede detectarse de manera directa mediante electroforesis en gel de agarosa. El ejemplo muestra la detección de fragmentos amplificados en dos de tres carriles en el gel. 4) La sensibilidad de detección puede aumentarse mediante el uso de la sonda interna después de la transferencia de Southern. El ejemplo muestra la detección de un tercer fragmento del mismo tamaño que no se observó en el gel original debido a que la cantidad de DNA era demasiado pequeña. De: Principios de diagnóstico por laboratorio de las enfermedades infecciosas, Sherris. Microbiología médica, 6e Citación: Ryan KJ, Ray C. Sherris. Microbiología médica, 6e; 2017 En: Recuperado: October 09, 2017 Copyright © 2017 McGraw-Hill Education. All rights reserved