OBJETIVOS Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente

Presentación del tema: "OBJETIVOS Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente"— Transcripción de la presentación:

1 TÉCNICAS de LABORATORIO NEUROMUSCULAR con aplicabilidad clínica INMUNOLOGIA

2 OBJETIVOS Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente
Destacar sus utilidades, ventajas e inconvenientes Análisis crítico con ejemplos reales de artículos destacados

3 RESUMEN Inmunohistoquímica Técnicas basadas en células ELISA
Diagnóstica Investigación Screening autoanticuerpos Confirmación de reactividad Técnicas basadas en células Inmunocitoquímica Citometría de flujo ELISA Western-blot Cromatografía de capa fina

4 INMUNOHISTOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

5 Inmunohistoquímica Inmunohistoquímica: es un procedimiento que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, para la localización e identificación de un antígeno en una muestra tisular. 2 tipos de anticuerpos

6 Inmunohistoquímica Antígenos Anticuerpo 1° Anticuerpo 2°

7 Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia directa
Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Anticuerpo 1° Antígenos Antígenos

8 Marcado mediante enzimas
Inmunohistoquímica Marcado con fluorocromo Marcado mediante enzimas + sustrato

9 APLICACIONES Inmunohistoquímica
Detectar la presencia/ausencia de una moleculas concretas en un tejido Detectar moleculas que están y no deberían estar Detectar moléculas que no están y deberían estar Analizar el patrón de tinción Si las moléculas están donde tienen que estar y en la proporción adecuada.

10 DISTROFINA

11 MHC I

12 INMUNOHISTOQUÍMICA INVESTIGACIÓN

13 UTILIDAD Enfermedad inmunes y no inmunes Enfermedades inmunes
Demostrar la presencia de anomalias estructurales o la alteración del patrón de tinción de determinadas proteinas relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad Enfermedades inmunes Demostrar que el suero/LCR de pacientes reacciona contra un tejido relevante para la enfermedad estudiada.

14 EJEMPLOS PRIMER CASO

15 EJEMPLOS SEGUNDO CASO

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17 Ensayos diagnósticos celulares (cell-based assays)

18 INMUNOCITOQUÍMICA CITOMETRÍA DE FLUJO

19 Cultivo celular y transfección

20 Tipos de Cultivo Primarios: provienen de una persona/animal y su crecimiento es limitado. Ej: musculares, endoteliales, neuronas… Líneas: Células immortalizadas, crecimiento ilimitado, amplia utilización en investigación. Ej: HEK, CHO, HeLa….

21 Cultivo de biopsias musculares de pacientes
Cultivo de explantes Separación con CD56+ Proliferación de mioblastos Diferenciación a miotubos

22 Inmunocitoquímica

23 Transfección: partículas lipídicas

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25 Procéso immunocitoquímica
Célula

26 Célula

27 Proyecto de busqueda de nuevos antígenos en CIDP
Contactin-1 CASPR1/Contactin-1 (Contactin1 complex) Neurofascin155 Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged

28 VENTAJAS ICC Expresión proteínas en su conformación nativa
Incluye modificaciones post-traduccionales Ideal para proteinas de membrana Permite el estudio de proteinas humanas sobre líneas celulares humanas Permite valorar el patrón de tinción (aspectos cualitativos) Sencillo y relativamente barato. Puede utilizarse de la misma manera o con mínimos cambios para muchas proteínas.

29 DESVENTAJAS No es útil para complejos de proteínas o proteínas con interacciones complejas Diferencias post-traduccionales respecto a proteina en su tejido de origen (diferente glicosilación, splicing…) No cuantitativo No mecanizable, consume tiempo.

30 CITOMETRIA DE FLUJO

31 VENTAJAS En general las mismas que la ICC más Cuantificable
Mecanizable

32 DESVENTAJAS Similares a la ICC, más
No permite análisis cualitativo (localización de la tinción…) Discrimina peor reactividad inespecífica

33 ELISA

34 ELISA ELISA: es un inmunoensayo para la cuantificación de un antígeno o anticuerpo mediante la inmovilización en una superficie sólida de un anticuerpo o antígeno, respectivamente.

35 ELISA Tipo Sandwich Indirecta
Detección de anticuerpos anti-gangliósidos en suero

36 ELISA

37 ELISA

38 ELISA Dilución punto final (cuando deja de ser positivo)

39 Analisis resultados Dos formas
Determinación pacientes positivos en función de una señal umbral Mejor especificidad Comparación de grupos

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42 VENTAJAS Versátil. Válido para muchos tipos de ensayo
Gangliosidos Proteinas Acidos nucleicos Sencillo y barato. Permite muchas determinaciones en poco tiempo Muy bueno para moléculas sencillas, no dependientes de conformación, pero válido para moléculas dependientes de conformación Mayor sensibilidad que otras pruebas diagnósticas Permite titular lo sueros

43 INCONVENIENTES Resultados variables, muy dependiente de condiciones externas de temperatura, tiempos de incubación, el estado de la molécula analizada… Más reactividad inespecífica, especialmente con sueros. Falsos positivos No válido para moléculas muy dependientes de conformación, por ejemplo, con muchos dominios transmembrana Necesidad de proteinas recombinantes. Proteinas purificadas o ELISA de tejidos, muy sucios.

44 WESTERN BLOT

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46 WB para Disferlina Western blot Dysferlin Β- actin Control 1 250 150
100 75 50 37 2 Marcador Dysferlin Β- actin

47 WB para distrofina Western blot 1 2 3 1 2 3 Distrofina ROD (Dys 2)
Distrofina Control Paciente 1 Paciente 2 250KDa ROD (Dys 2) Carboxi (Dys 3) Dys 1 Dys 2 Dys 3

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49 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

50 Características de los gangliósidos
Glicoesfingolípidos: ceramida + uno o más azúcares (hexosas) Selección de algunos de los gangliósidos relevantes en las neuropatías (neuropatía motora multifocal y los síndromes de neurona motora inferior). 

51 TLC de gangliósidos lámina de aluminio con gel de sílice

52 TLC de gangliósidos

53 Técnicas de determinación
Cromatografía en capa fina No permite la cuantificación Mayor especificidad en la determinación Placa Cromatografía silica gel solución de gangliósidos standard revelada con resorcinol incubación con el suero del paciente anti-IgG/IgM humana marcada con peroxidasa revelado por quimioluminiscencia

54 Técnicas de determinación
Cromatografía en capa fina, patrones de reactividad

55 Interpretación de los resultados
DISIALOSIL

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59 INMUNOHISTOQUÍMICA EJERCICIO 1

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62 INMUNOCITOQUÍMICA EJERCICIO 2

63 NEURONAS DRG – CIDP ATAXICA

64 ELISA EJERCICIO 3

65 WESTERN-BLOT EJERCICIO 4

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67 Western blot 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dysferlin Β- actin 237KDa 42KDa carril
Dysferlin 237KDa Β- actin 42KDa carril Name DYSF ACTINA DYSF/ACT 100% expresión 1 control 59,06 163,56 0, 100 2 paciente 1 1,17 115,78 0, 2, 3 paciente 2 27,1 95,23 0, 78, 4 paciente 3 38,6 138,89 0, 76, 5 paciente 4 14,94 149,3 0, 27, 6 paciente 5 37,03 136,96 0, 74, 7 paciente 6 26,36 116,77 0, 62, 8 paciente 7 1,97 151,08 0, 3, 9 paciente 8 47,45 159,14 0, 82,

68 TLC EJERCICIO 5

69 AMAN

70 CANOMAD