HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND

PREVALENCIA Hemofilia A 1/5000 - Hemofilia B 1/25000 - VWD 3% población

Propéptido Subunidad Madura protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S 1 2050 D1 D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

vWF Ensamble Multímeros RETICULO ENDOPLASMICO GOLGI vWF Ensamble Multímeros Furina Sadler JE, 2005

vWF Ensamble y Catabolismo Proteolisis aumentada (vWD2A) ADAMTS-13 kproteolisis Inicial Plasma vWF Ensamble y Catabolismo ksecreción kdepuración Depuración aumentada (vWD1 Vicenza) Sadler JE, 2005

FACTOR VIII A1 A2 B A3 C1 C2 Secreción Preactivación Activación NH 2 A1 A2 B A3 C1 C2 Secreción Preactivación Activación Inactivación 200kD 80kD IIa 1648 90kD HRG 80kD IIa 740 IIa 50kD 43kD 73kD 372 APC IIa Xa Xa 1689 45kD 67kD 336 1721 Lollar P & Parker CG, 1989

FVIII-VWF FVIIIa FVIII VWF N N C C S-S S-S IIa, FXa Vlot et al., 1998 A1 A2 FVIIIa C2 C1 A3 IIa, FXa 372 A2 FVIII 740 A1 C1 A3 B VWF C2 1689 N N C C S-S S-S Vlot et al., 1998

FVIII/VWF - Propiedades Adhesión Endotelio/Sub Transporta FVIII Clínica Hemofilia vWD Producción S. Hepáticos C. Endoteliales Megacariocitos Gen Cromosoma X Cromosoma 12 Molécula Heterodímero Multímero Función Coagulación Procofactor

FVIII/VWF - Nomenclatura Factor VIII Antígeno FVIII:Ag Función FVIII Factor von Willebrand Proteína Madura VWF VWF:Ag Cofactor Ristocetina VWF:RCo Unión al Colágeno VWF:CB Unión al Factor VIII VWF:FVIIIB ISTH

HEMOFILIA A Recesiva Ligada al sexo (gen FVIIICr X) PORTADORA HEMOFILICO

HEMOFILIA Modo de Herencia

HEMOFILIA Modo de Herencia

HEMOFILIA Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FVIII disminuido

HEMOFILIA - Clasificación Severa < 1% VIII Moderada 1-5% VIII Leve >5% VIII

HEMOFILIA Diagnóstico de Portadoras

PORTADORA OBLIGADA Padre hemofílico Hijo hemofílico y antecedentes (vía materna) 2 o más hijos, sin antecedentes familiares No requiere estudio

PORTADORA POTENCIAL Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Dificultad diagnóstica

PORTADORAS Lyonización Ovulo Fertilizado Heterocigota Clones XM XP XP XM XM XP XP XM XP XM XM XP XM XP

PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIII Portadoras Normales probabilidad 50 100 FVIII

Bioensayos DESVENTAJAS Probabilidad Error por lyonización extrema

Análisis de ADN VENTAJAS Certeza Independiente de lyonización

Análisis de ADN Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones Complejo Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones del gen No aplicable a todos los casos

IDENTIFICACION INDIRECTA No Certeza Análisis de segregación de RFLP ? -/+ - - -/- PORTADORA (-) asociado al defecto

50% hemofílicos severos IDENTIFIACION DIRECTA Certeza Inversión del intrón 22 ↓ 50% hemofílicos severos

IDENTIFIACION DIRECTA Inversiones Deleciones Inserciones Mutaciones “sin sentido” Mutaciones “sentido falso”

HEMOFILIA B Recesiva Ligada al sexo (gen FIXCr X) PORTADORA HEMOFILICO

HEMOFILIA - Clasificación Severa < 1% IX Moderada 1-5% IX Leve >5% IX

HEMOFILIA B Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FIX disminuido

Propéptido Subunidad Madura protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S 1 2050 D1 D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

VWD Clasificación Revisada Sadler E, 1994 Tipo 1 Deficiencia cuantitativa parcial Tipo 2 Alteración cualitativa Tipo 3 “Ausencia”de VWF

VWF Cromosoma 12 (12p1212pter) VWD Genética VWF Cromosoma 12 (12p1212pter)

VWD – TIPOS Frecuencia (%) Tuddenham (134) 75 19 6 Lenk (111) 76 12 Nilson (106f) 70 10 20 Hoyer (116) 71 23 Awidi (65) 59 29,5 11,5 Berliner (60) 62 9 29 Castaman G, 2003

VWD Serie 1885 Pacientes FVIII 61,6% VWF:Ag 62,2% TS 58,4% (Tipo I 91% ) FVIII 61,6% VWF:Ag 62,2% TS 58,4% Woods AI, 2001

Modificadires Ambientales Enfermedad primariamutación VWF Expresión Variable Penetrancia Incompleta Chance Modificadires Ambientales edad, género, trauma Enfermedad primariamutación ? Genes modificadores Niveles Variables VWF Difícil Diagnóstico Ginsburg D, 2001

VWF-Variabilidad Individual Familiar

VWF-Variabilidad Factores 40% no genéticos 60% genéticos

VWF-Variabilidad Factores no-genéticos Edad Estrés Ejercicio H. Tiroideas Estrógenos F.Aguda

VWF-Variabilidad Factores genéticos Grupo ABO  20-30% variabilidad Grupo “O” VWF Hipótesis Glicosilación Alteración procesamiento estabilidad secreción

VWD Distribución según grupo ABO “AB” 0,6%  difícil diagnóstico “O” 70%  más sintomático > frecuencia de consulta Woods AI, 2001

VWF Pruebas Específicas Cuantitativa Cualitativa VWF:Ag SI NO VWF:RCo SI SI VWF:CB SI SI Multímeros SEMI SI

VWF-ELISA 1 2 3 4 1. Anti-VWF inmovilizado 1 2 3 4 a-vWF vWF a-vWF-HRP Color-Abs 2. Incubación con muestra o control 1. Anti-VWF inmovilizado 3. Incubación con anti-VWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

Agregación c/Ristocetina VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina

Agregación c/Ristocetina VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina PRP Plaquetas del paciente Plasma del paciente

Agregación c/Ristocetina VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina PRP Plaquetas del paciente Plasma Ristocetina Agregometría

Agregación c/Ristocetina Normal Agregación c/Ristocetina vWD-Tipo 1 vWD-Tipo 2A vWD-Tipo 3 Kasper C, 2005

VWF:CB Unión Colágeno 1 2 3 4 1. Inmovilización 5 6 2. Bloqueo 1 2 Colágeno Tipo III BSA 3 a-vWFconejo Muestra 4 Esferas poliestireno IgG F(ab’)2* 1. Inmovilización 5 6 2. Bloqueo 3. Colágeno  VWF Citometría de flujo 4. VWF  a-VWF 5. a-VWF  IgGF(ab’)2fluoresceína 6. Adquisición

Actividad VWF-ELISA 1 2 3 4 a-vWF vWF a-vWF-HRP Color-Abs 1. AcMo a-vWFepitope funcional inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-vWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

Agregación c/Ristocetina Kasper C, 2005

VWF-Análisis Multimérico grandes intermedios-pequeños (banda 1) (banda 2) Línea 1 Línea 2 Línea 3 Lane 3> 2B Normal 2A

vWD-Tipo 2 Clasificación Revisada Sadler E, 1994 2A  función plaquetaria  Multímeros APM 2M  función plaquetaria c/Multímeros APM 2N  afinidad VWF-FVIII* *símil Hemofilia A, autosómica 2B  afinidad VWF-GPIb-IX

Propéptido Subunidad Madura protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S 1 2050 D1 D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I X RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

VWF:FVIIIB Enlace FVIII  VWF 1 2 3 4 a-vWF vWF FVIII Color-Abs CaCl2 0,4M 1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación FVIII purificado/CaCl2 4. Incubación con sustrato cromogénico

VWF:FVIIIB Enlace FVIII  VWF -3.50 -3.25 -3.00 -2.75 -2.50 -2.25 -2.00 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 Referencia Paciente 1 Paciente 2 Absorbancia 405nm

2N-Variante Normandy Biología Molecular. -. Secuenciación. -. Enz 2N-Variante Normandy Biología Molecular - Secuenciación - Enz. restricción

VWF- Arg19Trp (C2594T) Exón 18 Enzima BspMI Mutación Normal 1-244 pb 2-148 pb 3-96 pb Normal 148 pb 96 pb Mutado 244 pb 1 2 3 Mutación Normal

Screening VWD Estrategia Diagnóstica * T. Sangría APTT (fVIII) Adhesividad Tiempo de obstrucción (PFA) *no permiten excluir VWD

Diagnóstico VWD Estrategia Diagnóstica -VWF plasma/plaquetas VWF:Ag VWF:RCo VWF:CB -FVIII en plasma

Clasificación VWD Estrategia Diagnóstica Multímeros RIPA Unión GP plaquetarias VWF:FVIIIB Biología Molecular

vWD- Importancia Dignóstica VWF:RCo Prueba más sensible VWF:Ag CorrelacionaVWF:RCo Ratio=1Tipo1 Ratio<1Tipo2 FVIII Util para el manejo clínico T. Sangría CorrelacionaVWF:RCo (T1) Detecta defecto plaquetario RIPA Detecta Tipo 2B Castaman G, 2003

vWD- Importancia Dignóstica A.Multimérico DiscriminaTipo 2M, 2A, 2B VWFplaquetario Predice respuesta DDAVPTipo 1 VWF:FVIIIB DetectaTipo 2N VWF:CB CorrelacionaVWF:RCo (T1) Sensibilidad  colágeno CT PFA-100 Especificidad (?) Castaman G, 2003

HEMOFILIA VON WILLEBRAND Diagnóstico Diferencial

Enfermedad de von Willebrand Cofactor de ristocetina * Antígeno de factor vW  o N Factor VIII  o N Tiempo de Sangría  o N *excepto la variante 2N

Hemofilia Cofactor de ristocetina N Antígeno de factor vW N Factor VIII  Tiempo de Sangría N

Hemofilia-VWD 2N Hemofilia VWD2N VWF:RCo N N Factor VIII   VWF:FVIIIB N 

VWD Laboratorio Diagnóstico Control de terapéutica

COAGULPATIAS Orientación Diagnóstica

PRUEBAS V. INTRINSECA TTPA V. EXTRINSECA TP V. FINAL TT FC XII XIIa XI XIa Ca2+ V. EXTRINSECA TP X Xa Va FL Ca2+ FT VIIa Ca2+ IX IXa VIIIa FL Ca2+ Fibrinógeno M. Fibrina Fibrina V. FINAL TT II IIa XIIIa Activación

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

Gracias