VEGF: EXPRESION DE LIGANDOS Y RECEPTORES EN TEJIDO TUMORAL Y ESTROMA EN CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO Rafael Sirera, Elena Sanmartín, Eloisa Jantus, Tom Donnem, María José Safont, Vega Iranzo, Alfonso Berrocal, Ana Blasco, Roy Bremnes, Carlos Camps Laboratorio de Oncología Molecular, FIHGUV Servicio Oncología Médica , CHGUV University of Tromsø, Tromsø, Norway

Maturation and modulat. Molecules Growth Factors and their receptors VEGF/VEGFRs PDGF/PDGFRs FGF/ FGFRs Chemokines/ Chemok-R Neuropilin Signaling molecules MAPK PKA, PKB, PKC Raf/Ras COX-2 Adhesion molecules Integrins Cadherins (VE/N) ECM proteins Collagen Fibronectin Laminins Trombospondin Transcrip. Factors HIF NFkB FOX Proteinases MMP9 MMP2 Maturation and modulat. Molecules Angiopoietins/ Tie Ephrins Wnt/Fzd INDUCTORS COM. ORAL Poster 154 INHIBITORS Existen numerosas evidencias científicas acerca de que la carcinogénesis y la angiogénesis tumoral están influenciadas y controladas por interacciones celulares derivadas de una compleja relación entre componentes del estroma, tumor y la matriz extracelular. Estas interacciones se realizan a través de mediadores angiogénicos, los cuales pertenecen a categorías funcionales muy diferentes tales como: factores de crecimiento, moléculas de señalización, factores de transcripción, etc. En este congreso presentaremos datos preliminares de los análisis de expresión de mediadores angiogénicos en muestras de tumor y estroma que forman parte de un proyecto mas complejo, en particular presentaremos los resultados de los estudios de expresión de PDGFy sus receptores en el Poster 154, y en esta presentación expondré los resultados sobre expresión de ligandos y receptores de VEGF y sus co-receptores, las neuropilinas.

VEGF:Ligands and Receptors Rafii, 2002 Carmeliet, 2001 Sawano, 2001 Hattori, 2002 Luttun, 2002 Yancopoulos, 2000 Robinson, 2001 Como es sabido, la familia de ligandos del VEGF incluye a varias glicoproteínas: VEGF-A,-B,-C y –D y al PlGF que señalizan a través de tres receptores con actividad tirosina-kinasa. En esta señalización también intervienen moléculas co-receptoras como las neuropilinas que facilitan la presentación y unión del ligando a su receptor. VEGFR-2 mediate almost all of the known cellular responses to VEGF VEGFR-1 modulate VEGFR-2 signaling, sequestering VEGF VEGFR-3 mediates lymphangiogenesis NRP-1 facilitate the presentation and binding of VEGF to its receptor.

METHODOLOGY Pfaffl formulae: 2-ΔΔCt RNA extraction Cores (ɸ 0.6 mm) N=64, NSCLC METHODOLOGY tumor stroma RNA extraction (RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit, Ambion) Cores (ɸ 0.6 mm) NCI-H23 NSCLC, core Reverse transcription Por lo tanto para estudiar la expresión de los genes de la familia VEGF hemos analizado 64 muestras provenientes de cores obtenidos a partir de tejido parafinado, tomando muestras que correpondan a tumor y a estroma tumoral de cada paciente. A partir de estos cores, extrajimos RNA, el cual como vemos en la figura estaba bastante degradado, y luego de retrotranscribir las muestras realizamos amplificación por PCR a tiempo real, utlizando primers y sondas con tecnología TAqMan Dado que las muestras estaban muy degradadas, tuvimos cuidado de escoger siempre amplicones con tamaño inferior a las 70pb y en los casos en que fue posible, diseñados hacia el extremo 5’ de los mRNAs de los genes deseados. Los resultadios fueron expresados como valores de expresión relativa con respecto a un gen control endógeno (b-actina) y normalizados contra la expresión en una línea celular (NCI-H23) RTqPCR Pfaffl formulae: 2-ΔΔCt β-actin (endogenous control) NCI-H23 (calibrator) <70 bp amplicons

CLINICO-PATHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE STUDIED PATIENTS Age 68.5 y (30-81) Gender Males 86% Histology SCC Adenocarc. Others 76% 19%. 5% Stage I II IIIa 64.3% 31.0% 4.8% Smoking Previous/never Present 28.6% 71.4% Performance status Normal Slightly reduced 69.0% N= 64, NSCLC (resectable) Median follow up 70 months Todos las muestras incluidas pertenecian a pacientes con NSCLC en estadios resecables, no tratados. La edad mediana de los pacientes fue de 68.5 años, el 86% eran varones. El 76% de los tumores estudiados fueron de tipo epidermoide y la mediana de seguimiento de la cohorte fue de 70 meses.

PlGF vs Histology Gene expression vs clinico-pathological variables Expression in Tumor (T) Stroma (S) Variable p (Mann Whitney test) NRP1 (S) VEGFB (S) PS 0.033 0.039 VEGFR3 (T) NRP2 (T) VEGFR2 (T) Differentiation grade. 0.004 0.032 0.002 Smoking 0.048 PlGF vs Histology Mean + 2SEM Nuestros datos mostraban que existían diferencias significativas en la expresión de algunos de los genes estudiados con respecto a algunas variables clinico-patologicas. Asi por ejemplo, la expresión de NRP1 y VEGFB en S tenían dif significativas de acuerdo al PS de los pacientes. La expresión de VEGFR 2 y 3 y NRP2 en tumor difería de acuerdo al grado de diferenciación de los tumores. En cuanto a la expresión de PlGF, vemos que es mayor de manera significativa en los carcinomas de tipo epidermoide, tanto en las muestras de estroma tumoral como las de tumor

VEGFR2 expression in tumor poor moder/well Cuando analizamos la expresión de VEGFR2 en tumor, vemos que es mayor la expresión en aquellos pacientes que no presentan recidivas , o en los tumores bien o moderadamente diferenciados. Esto indicaría que la expresión elevada del R2 se relaciona con fenotipos tumorales mas benignos.

VEGFR2 expression in tumor VEGFR2 expression in tumor OS (months) En concordancia con estos resultados, vemos que el grupo de pacientes que presentan valores de expresión por debajo de la mediana de VEGFR2 tienen peor pronóstico clínico, tanto cuando analizamos el tiempo a la progresión, como cuando lo hacemos estudiando la supervivencia global

Expression of VEGFA in Stroma and VEGFR2 in Tumor 7.3 months 74.9 months 6.1 months 73.7 months Expression of VEGFA in Stroma and VEGFR2 in Tumor Pero, que ocurre cuando miramos lo que ocurre en estroma??? En esta figura vemos que existe un grupo de con un tiempo a la progresión muy corto, que es el que presentaba valores bajos de expresión del R2 pero que cuando se combina con la expresión elevada (tomando como valor de corte la mediana) de VEGFA en estroma, nos permite diferenciar un subgrupo de muy mal pronóstico, y por otro lado, tenemos al subgrupo de pacientes que presentan de manera concomitante valores bajos de VEGFA en estroma y valores elevados de VEGFR2 en tumor, son los que tienen un tiempo a la progresión mucho mayor. Y los mismo ocurre cuando analizamos la supervivencia global.

VEGFR2  TUMOR VEGFR2 VEGFA Estos resultados, si bien preliminares, nos permiten pensar en que nos encontramos ante dos escenarios diferentes: uno en el cual las células tumorales expresan mas VEGFR2, y por lo tanto son capaces de “capturar” a su ligando VEGFA, por lo que en el ambiente, quedaría poco VEGFA disponible para unirse a los R2 de las células endoteliales, y por lo tanto estaríamos ante la presencia de un fenotipo menos angiogénico,

VEGFR2  TUMOR Angiogenesis VEGFA VEGFR2 Por el contrario, en aquellos casos, en que existe una baja expresion de R2 en tumor, quedaría mas VEGFA producido por el estroma disponible para unirse a los receptores de las células endoteliales e inducir mas neovascularización tumoral, por lo que este tipo de “biología” del tumor-estroma, nos definiría un biottipo mas angiogénico, y por lo tanto mas maligno Angiogenesis

CONCLUSIONES LA ANGIOGÉNESIS ES UN PROCESO TEMPRANO EN EL DESARROLLO TUMORAL EL ESTUDIO DE EXPRESIÓN DE GENES ANGIOGÉNICOS EN ESTROMA Y TUMOR PERMITIRÍA DETECTAR SUBGRUPOS DE PACIENTES CON PEOR PRONÓSTICO CLÍNICO EN NSCLC. EL AGRUPAMIENTO DE PACIENTES DE ACUERDO CON SUS “PERFILES ANGIOGÉNICOS” NOS PERMITIRÍA SELECCIONAR MEJOR AQUELLOS SUBGRUPOS QUE PODRÍAN BENEFICIARSE DE UNA TERAPIA ANTIANGIOGÉNICA EN ESTADIOS TEMPRANOS Asi, podemos concluir que, si bien se trata de resultados preliminares, nuestros datos apoyan el hecho de que: La angiogénesis es un proceso temprano en el desarrollo del tumor. El estudio de expresión de marcadores angiogénicos en tumor y estroma nos permitiría detectar subgrupo de pacientes con diferente pronóstico. Tal vez, este agrupamiento nos ayudaría a seleccionar aquellos pacientes que pudieran beneficiarse de una terapia antangiogénica en estadios tempranos en NSCLC.