CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO Catedrática: Dra. Silvia Echeverría, Ph.D., Depto. Fisicoquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC.

FUNDAMENTOS DE SEPARACIÓN PRINCIPIOS GENERALES TÉCNICAS DE SEPARACIÓN TEORÍA MECANISMOS DE SEPARACIÓN

Mezclas y la necesidad de métodos de separación Complejidad de las muestras: Sangre, agua de río, alimentos licuados, entre otros. Las muestras pueden contener mezclas de solutos, micelas, coloides y otras partículas en suspensión.

Técnicas de separación clásicas Separación de componentes de interés Precipitación Destilación Extracción Soxhlet

Extracción con disolventes Extracción con ultrasonido (Líquido-líquido) Extracción en fase sólida

Extracción con Líquidos presurizados Extracción con microondas

CROMATOGRAFÍA Nombre genérico asignado a muchas y distintas técnicas de separación. El nombre se debe al botánico ruso Mikhail Tsweet, quién acuñó el término a principios de la década de 1900, cuando logró separar varios pigmentos de plantas tales como xantofilas y clorofilas, al hacer pasar soluciones de esta mezcla por columnas de vidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Cada pigmento recorrió la columna con diferente velocidad y terminó apareciendo cada componente como bandas de color. Chroma, palabra griega para color y Graphein que significa escribir.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Basada en la forma en que se ponen en contacto la FASE MÓVIL y la FASE ESTACIONARIA: En COLUMNA y en PLANO. Basada en el tipo de fase móvil: CG, CL, CFS.

Todas las formas de cromatografía se basan en la separación de muestras de mezclas al entrar en contacto con dos fases: fase móvil y fase estacionaria. Una de las fases se mueve en relación con la otra. Los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases de acuerdo con sus solubilidades (o afinidades) relativas hacia ellas. Los componentes que no interaccionan con la fase estacionaria pasan rápidamente con la fase móvil. Al revés, los componentes que si interaccionan con la fase estacionaria, se mueven con mayor lentitud.

Los componentes de la muestra se mueven con velocidades determinadas por los tiempos relativos que pasan en las fases móvil y estacionaria. A su vez, dichos tiempos quedan determinados por los coeficientes de partición para cada componente entre las dos fases. De esta forma, se pueden separar distintos componentes debido a la velocidad relativa con que atraviesan la fase estacionaria.

Se puede realizar la cromatografía de elusión (con dos fases líquidas) en varias formas distintas. En muchos casos la fase estacionaria es un disolvente (por ejemplo agua) adsorbido y por consiguiente, inmovilizado en un soporte sólido, como papel de celulosa, o sílice en una columna empacada. La muestra que se va a resolver o separar en sus partes componentes se disuelve en un pequeño volumen de un segundo disolvente que tendrá el papel de fase móvil. A continuación se agrega la solución de la muestra al soporte sólido (que contiene la fase estacionaria inmovilizada).

A medida que la fase móvil atraviesa la fase estacionaria, los solutos se distribuyen entre las fases de acuerdo con sus coeficientes de partición respectivos. Se pueden agregar más fases móviles para ELUIR los componentes de la fase estacionaria a distintas velocidades. (Puede imaginarse este tipo de cromatografía como una serie continua de extracciones líquido-líquido). Al final todos los componentes serán eluidos del sistema del que se trate y así la mezcla quedará separada.

TEORÍA DE LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS Coeficientes de partición Todas las separaciones cromatográficas están gobernadas por coeficientes de partición KD de solutos, entre las fases estacionaria y móvil. Para un soluto S se establece un equilibrio dinámico, esto es: S móvil S estacionario

El coeficiente de partición, KD, es igual a la relación de la concentración del soluto en las dos fases, tal como en la ecuación: KD = [S]est/[S]móv Donde KD es el coeficiente de partición y [S]est y [S]móv son las concentraciones molares del soluto S en las fases estacionaria y móvil respectivamente. En el caso ideal, el valor de KD debe permanecer constante dentro de un amplio margen de concentraciones de soluto, para asegurar que la relación misma de [S] est y [S] móv quede constante. Se puede suponer que la cromatografía efectuada bajo estas condiciones tiene comportamiento lineal, lo cuál permite hacer determinaciones cuantitativas a partir del cromatograma.

En la práctica, bajo la mayor parte de condiciones normales de trabajo, se puede suponer que KD es constante, aunque a concentraciones muy altas la fase estacionaria puede volverse parcial o totalmente saturada.

TIEMPO DE RETENCIÓN TIEMPO DE RETENCIÓN En esta figura se observa un cromatograma característico para una muestra que contiene un solo analito. El tiempo que transcurre luego de la inyección de la muestra hasta que se alcanza la concentración máxima del analito en el detector, se denomina Tiempo de Retención (tR)

El tiempo que tarda un analito en eluirse de una columna, también se llama tiempo de retención o tiempo de residencia. Si un soluto en la fase móvil no interacciona en absoluto con la fase estacionaria, se moverá con la misma velocidad que la fase móvil, dicho tiempo se puede representar como tmóv y también se le denomina, en algunas ocasiones, tiempo muerto (tM). Si el analito pasa una parte del tiempo en la fM y otra parte en la fE, su velocidad de avance estará determinada por el coeficiente de partición KD y en consecuencia, distintos analitos serán eluidos de la columna en tiempos distintos que dependen de sus coeficientes de partición dentro de la columna.

La velocidad lineal promedio del movimiento, u, de la fase móvil, se puede expresar de acuerdo a la ecuación: u = L/tmóv En donde L es la longitud de la columna. En forma similar, para cualquier pico cromatográfico, se puede expresar la velocidad lineal promedio de migración del soluto por medio de la ecuación: ṽ = L/tR El tiempo de retención tR de un soluto se puede relacionar con su coeficiente de partición KD expresando la velocidad de migración del soluto ṽ en función de una fracción de la velocidad de la fase móvil, tal como en la ecuación:

ṽ = u x fracción del tiempo en la fase móvil Sin embargo, se deben tomar en cuenta los volúmenes de las fases estacionaria y móvil, a los cuáles se les llama Vest y Vmóv respectivamente. Basados en lo anterior, la velocidad de migración del soluto para determinado pico cromatográfico, se puede expresar así: ṽ = u X 1/1+KD Vest/Vmóv

EL FACTOR DE CAPACIDAD Es un parámetro para comparar las velocidades relativas de migración de soluto en las columnas. Dicho factor k’ se puede calcular con la ecuación: k’ = (tR – tmóv)/tmóv En el caso ideal, k’ debe estar dentro del intervalo de 1 a 5. Si k’ es mucho menor que 1, la elución será tán rápida que será difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. Por lo contrario, si el factor capacidad es mucho mayor que 20, los tiempos de retención serán excesivos.