Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE · Western- blots Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

ELECTROFORESIS: Método analítico. En un campo eléctrico las moléculas cargadas migran en la dirección del electrodo que tiene una carga opuesta.

Movilidad electroforética Medición de la velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende de la pK de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. Influencias: tipo de buffer, concentración y pH, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.

ELECTROFORESIS SDS-PAGE SDS : dodecil sulfato de sodio DETERGENTE ANIÓNICO En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

Electroforesis SDS-PAGE REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio

¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

MATRIZ DE POLIACRILAMIDA Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

Acrilamida Químicamente inerte Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

Rango de separación (tamaño) En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa

ELECTROFORESIS SDS-PAGE GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH 6.8 Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS El buffer de corrida Tris/Glicina/SDS

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

Marcadores de Peso Molecular preteñidos ¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

Los geles se pueden teñir con: Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Distancia total Frente de corrida

Elaboramos una gráfica con los datos obtenidos de los estándares de peso molecular

Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa