Claudia Escobar.  Si se pretende estudiar una función particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del aparato de Golgi, es conveniente.

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1 Claudia Escobar

2  Si se pretende estudiar una función particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del aparato de Golgi, es conveniente aislar primero el organelo relevante en estado purificado. El aislamiento de un organelo particular en gran cantidad suele lograrse mediante la técnica de CENTRIGUCACION DIFERENCIAL.

3  Para efectuar esta técnica se procede primero a la rotura mecánica de las células con un homogeneizador mecánico. Las células se homogeneizan en una solución amortiguada isotónica, lo que previene la rotura de las vesículas de membrana por ósmosis. El homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones secuenciales cada vez con mayor fuerza centrífuga.

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5  La proteína debe aislarse en un estado relativamente puro antes de poder obtener información de la estructura o la función de una proteína particular. Por lo general la purificación de una proteína se realiza mediante la eliminación de los contaminantes por pasos.

6  La purificación de una proteína determinada suele requerir el uso de técnicas sucesivas que aprovechan las diferentes propiedades de las proteínas que se separan. La purificación se mide como un incremento en la actividad específica, que es el índice entre la cantidad de esa proteína y el total de proteína presente en la muestra. Si la proteína es una enzima, puede recurrirse a su actividad catalítica como prueba para vigilar la purificación.

7  El primer paso en la purificación selectiva debe ser uno que pueda realizarse en una preparación muy impura y pueda producir un gran aumento en la actividad específica. Las propiedades de la solubilidad de una proteína depende mucho de la distribución de cadenas laterales hidrófilas e hidrófobas en su superficie. La solubilidad de una proteina depende de un equilibrio relativo entre las interacciones proteína-solvente y proteina- proteína.

8  En las técnicas de cromatografía líquida, los componentes en una mezcla pueden relacionarse con una de dos fases alternativas: una fase móvil, que consistente en un solvente en movimiento, y una fase inmóvil, que es la matriz a través de la cual se mueve el solvente. Las proteínas que van a fraccionarse se disuelven en un solvente y luego se para por la columna. Los materiales que conforman la fase inmóvil contienen sitios a los que las proteínas en solución pueden unirse.

9  La carga iónica se usa como base para la purificación en diversas técnicas, inclusive en esta. La carga general de una proteína es la suma de todas las cargas individuales de sus aminoácidos componentes. La carga de cada proteína depende del pH. Existe un pH para cada proteína en el que el numero total de cargas negativas es igual al de cargas positivas. Este pH es el punto isoeléctrico, en el que la proteína es neutra. La cromatografía de intercambio iónico depende del enlace iónico de las proteínas con una matriz de material inerte, como la celulosa, que contiene grupos cargados unidos mediante enlace covalente.

10  El material de separación consiste en cuentas diminutas que se empacan en una columna a través de la cual la solución de proteína pasa lentamente. Los materiales que se emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos con enlaces cruzados de distinta porosidad, lo que permite que las proteínas se difundan dentro y fuera de los poros (cuentas).

11  La cromatografía por afinidad aprovecha las propiedades estructurales únicas de una proteína, lo que permite que una especie de proteína se retire de manera específica de la solución mientras que las demás quedan en ésta. A diferencia de otros procedimientos cromatográficos que separan proteínas con base en su tamaño o carga, la cromatografía por afinidad puede lograr una purificación casi total de la molécula deseada en un solo paso.

12  Una de las maneras de aprender respecto a la función de una proteína consiste en identificar las proteínas con las que interactúa. La técnica de uso más frecuente para buscar interacciones proteína-proteína es el sistema de dos híbridos de levadura, creado por stanley fields y ok-kyu song. Esta prueba para la interacción entre dos proteínas depende de que una célula sea capaz de reunir dos partes de un factor de transcripción.

13  La electroforesis depende de la capacidad de moléculas para migrar cuando se colocan en un campo eléctrico. En este proceso las proteínas son impulsadas por una corriente que se aplica a través de una matriz gelatinosa. La matriz se compone de polímeros de una pequeña molécula orgánica que establece enlaces cruzados para formar un tamiz molecular. Mientras mayor sea la densidad de carga, la proteína se impulsa con más fuerza por el gel y por tanto la migración es más rapida.

14  SDS-PAGE  Electroforesis en gel bidimensional  Medición y análisis de proteínas: Uno de los métodos mas sencillos y usuales para identificar la cantidad de proteína o ácido nucleico presente en una solución determinada es medir la cantidad de luz de una longitud de onda específica que absorbe esa solución.

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16  Los espectrómetros de masa son instrumentos analíticos que se usan sobre todo para medir las masas de moléculas, determinar fórmulas químicas y estructura molecular, y para identificar sustancias desconocidas. Una vez que las masas moleculares de los péptidos en la muestra se conocen, la proteína completa puede identificarse. Si la proteína no se identifica uno o más de los péptidos pueden fragmentarse en un segundo paso para someterlos a otra ronda de espectrometría de masa.

17  La cristalografía por rayos x utiliza cristales de proteína que se bombardean como un fino haz de rayos X. la radiacion que se dispersa por lo electrones de los átomos de la proteína golpea un detector sensible a los electrones situado detrás del cristal. El patrón de diferenciación que el cristal produce depende de la estructura interna de la proteína; la gran cantidad de moléculas en el cristal refuerza las reflexiones y ocasiona que se comporte como si fuera una molécula gigante.

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