CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VARIEDADES DE CAÑA DE AZUCAR (SACCHARUM SPP HÍBRIDO) CON MARCADORES INTERMICROSATELITES (ISSR) Torrealba, D.; Molina, S.; Domínguez, D. y Rea, R. Instituto de Estudios Avanzados (IDEA). Sartenejas Caracas dtorrealba@idea.gob.ve, tdario975@gmail.com I. Introducción II. Materiales y métodos 1.- Extracción de ADN: (Dellaporta et al, 1983) con modificaciones 0,5 g de tejido Buffer de extracción Precipitación de proteínas Precipitación del ADN En Venezuela, la caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) es un rubro tradicional que se cultiva en el país desde tiempos coloniales. Recientemente, la caña de azúcar ha ganado importancia en la producción de biocombustibles y en la alimentación animal. El desarrollo de nuevas variedades en caña de azúcar permite aumentar la producción de sacarosa, y enfrentar grandes desafíos a los estreses bióticos y abióticos. El conocimiento de la variabilidad genética existente en el germoplasma de caña de azúcar es clave para los procesos de mejoramiento genético, permitiendo hacer cruces más efectivos con el propósito de obtener nuevos cultivares. Los marcadores moleculares intermicrosatelites (ISSR) se han utilizados ampliamente en estudios de diversidad, en numerosas especies de plantas. En caña, estos marcadores han permitido evaluar la diversidad genética de progenitores (Latorre et al., 2013), así como la caracterización molecular de diversos cultivares (Alves et al., 2009; Devarumath et al., 2012).. El objetivo de este trabajo fue evaluar la variabilidad genética de un grupo de variedades de caña de azúcar de alto valor comercial mediante marcadores moleculares ISSR Macerados con nitrógeno líquido. Tris HCl pH 8 100mM, EDTA 50 mM, NaCl 500mM, SDS 1.25% p/v 400ul de Acetato de potasio 5M 1V de isopropanol y 50ul de acetato de sodio 3M pH 5.2 2.- Amplificación de regiones ISSR: (815, 823, 835, 846, 850, 855, 864, 874, 880 y 890) Componentes Concentración 5XBuffer PCR 1X MgCl (25mM) 3mM Primer (10uM) 0,25uM ADN 2,5ng Taq polim. 1U dNTP`s (10mM) 0,2mM 96 ºC 94 ºC 48-53 ºC 72 ºC 15 ºC 7:00 0:30 2:00 40 ciclos Figura 1.- Programa de la PCR Tabla 1.- Mezcla para la PCR 3.- Análisis de Datos: Los fragmentos de amplificación fueron codificados de acuerdo a un marcador dominante, asignando (1) para presencia y (0) para ausencia de bandas, generando una columna por locus para cada iniciador. El agrupamiento de los materiales de caña se evaluó mediante el Análisis de Coordenadas Principales (ACoP), utilizando la disimilitud debida al coeficiente de Simple Matching. El programa utilizado fue InfoGen versión 2011. III. Resultados y Discusión De doce iniciadores aleatorios ISSR utilizados, se seleccionaron diez, para el análisis (815, 823, 835, 846, 850, 855, 864, 874, 880 y 890), pues fueron estos los que generaron bandas de buena resolución para todas las muestras; el resto (812 y 841) fueron descartados para evitar falsos positivos. Estos 10 iniciadores produjeron un total de 96 bandas, de las cuales 71 fueron polimórficas (73,96 %), con un tamaño entre 270-1700pb. Así mismo, los iniciadores seleccionados generaron información de manera diferente, medida ésta en términos de número de fragmentos polimórficos y Contenido de Información Polimórfica (PIC); destacándose el iniciador 850 con el mayor PIC observado (0,37) lo cual lo hace seleccionable para futuros estudios de ISSR con estos genotipos de caña (Tabla 1). En la Figura 2, se muestra el espacio bidimensional obtenido del Análisis de Coordenadas Principales (ACoP), el cual, utilizando el coeficiente de Simple Matching, explicó el 45,5% de la variabilidad presente en los materiales evaluados con los dos primeros ejes, formándose 3 grupos, uno integrado por las variedades CR74-250 y CP74-2005. El grupo dos lo integraron las variedades C323-68 y CP72-2086 y el grupo tres integrado por las variedades SP701284, CR87-339, PR692176 y RB855035. Con este estudio se logró determinar que las variedades de caña más sembradas en el país son genéticamente variables entre ellas, permitiendo contar con una base genética amplia. Esto sugiere incorporar estos cultivares al programa de mejora genética y con énfasis en dirigir cruces entre los tres grupos contrastantes. Figura 2.- Agrupamiento entre las 8 variedades de caña de azúcar, basado en la disimilaridad debida al coeficiente de Simple Matching y 10 iniciadores ISSR. Tabla 3.- Iniciadores ISSR y nivel de polimorfismo en muestras de caña de azúcar. Iniciador Secuencia Rango (Pb) Bandas Polimórficas PIC 815 5’-CTC TCT CTC TCT CTC TG-3’ 280 - 1650 10 0,28 823 5’-GAG AGA GAG AGA GAG AA-3’ 430 – 1200 6 0,25 835 5’-AGA GAG AGA GAG AGA GYC-3’ 430 – 1580 11 0,30 846 5’-CAC ACA CAC ACA CAC AAG T-3’ 420 – 1700 8 0,26 850 5´-GTGTGTGTGTGTGTGTYC-3 480 – 1300 2 0,37 855 5´-ACACACACACACACACCTT-3 650 – 2500 0,29 864 5´-ATGATGATGATGATGATG-3 470 – 1150 0,31 874 5’-GAG AGA GAG AGA GAG ACT C-3’ 380 - 830 1 880 5’-GGA GAG GAG AGG AGA-3’ 270 - 1620 12 890 5’-ACG ACT ACG GTG TGT GTG TGT GT-3’ 400 - 1470 7 IV. Referencias Latorre, C.; Rea, R.; Sosa, D.; Molina, S.; Demey, J.; Briceño, R.; De Sousa, O. (2013). Diversidad genética en germoplasma de Saccharum spp. mediante el uso de marcadores ISSR. MULTICIENCIAS, Vol. 13, Nº 1, (7 - 15) Gupta, M., Chyi, Y. S., Romero, S. J., Own, J. L., (1994). Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 89: 998-1006 Zietkiewicz, E., Rafalski, A., Labuda, D. (1994). Genome finger-printing by Simple Sequence Repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183.