Q-PCR.

Presentación del tema: "Q-PCR."— Transcripción de la presentación:

1 Q-PCR

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3 Métodos de cuantificación de expresión génica
Cuantificación Semi-cuantitativa Cuantificación cuantitativa

4 Menor eficiencia, se afecta la cuantificación .
Semi-cuantitativa Menor eficiencia, se afecta la cuantificación . Resultados inconsistentes y poco reproducibles Estudios cualitativos (técnica sencilla)

5 Cuantifica en la fase exponencial lineal
Cuantitativa Cuantifica en la fase exponencial lineal Mucho más eficiente confiable y reproducible.

6 El Ct se usa como referencia para determinar el nivel de expresión

7 ¿Para qué quiero cuantificar?
¿Cuál es el objetivo? ¿Para qué quiero cuantificar? ¿Qué sensibilidad de cuantificación necesito? ¿Cuáles son mis recursos? ¿Qué quiero cuantificar? ¿Cuántos genes voy a cuantificar? Las respuestas guiarán a las técnicas, reactivos, análisis y metodologías a las cuales debo orientarme ya que hay diferentes caminos para seguir.

8 Métodos de cuantificación
Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa Se utiliza una curva estándar Con o sin curva estándar

9 Cuantificación Absoluta
Para cuantificar utiliza curvas de calibración. Permite estimar el número exacto de copias del transcripto de interés.

10 Cuantificación Absoluta
mínimo 4 puntos. No se puede extrapolar por fuera del rango.

11 Cuantificación Absoluta

12 Cuantificación Relativa
Permite determinar el número relativo de copias de un transcripto Requiere una normalización de los datos que se lleva a cabo con un gen/es control (housekeeping o factores constitutivos). Dos tipos: con curvas estándar y sin curvas estándar

13 1) 2) 3) 11,5/9,6 = 1.198 3,2/4,8 = 0,666 1,198/0,666 = 1,799 La normalización me permite comparar la expresión del gen de interés sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión.

14 Sin curvas estándar control Método de análisis: 1º delta Ct 2º delta delta Ct 32-23 =9 5-9 = -4 3º =16 28-23 = 5

15 Toma de muestras y Extracción de RNA
Consideraciones a tener en cuenta: Diseño experimental, variabilidad de la técnica. Integridad del RNA, tomar en cuenta en todos los pasos del proceso. Fácilmente degradable. Presencia de RNAsas. Toma de muestras, tejido y guardado. Materiales, condiciones. Extracción de RNA Materiales, condiciones, procedimiento, duración y almacenaje. Presencia de RNAsas. Reactivos (PureLink, Trizol –Invitrogen-). Purificación

16 Objetivo: Eliminar restos de DNA genómico.
Tratamiento con DNAsa Objetivo: Eliminar restos de DNA genómico. RNA 5ul 30´ a 37º C 10x Reaction Buffer 1ul H20 3ul DNAse + EDTA 10´ a 65º C

17 Repeticiones de la RT. $$$
Retro Transcriptasa La enzima Paso crítico en cuanto a la variabilidad que puede generar este proceso para la cuantificación futura. Contaminaciones. Repeticiones de la RT. $$$ RNA+H20 10 ul 5´a 65º C Oligo dt 1ul dNTPs 1 ul SS II RT 1ul 50´ a 42º C 15´ a 70º C Ya tenemos el cDNA Ventajas y desventajas Reproducibilidad

18 Cuantificación semi cuantitativa