PCR Y SECUENCIACIÓN. PCR  Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa.  Su objetivo es obtener un gran número de fragmentos de un.

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1 PCR Y SECUENCIACIÓN

2 PCR  Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa.  Su objetivo es obtener un gran número de fragmentos de un ADN particular a partir de unos pocos.  Con un gran número de fragmentos de ADN de interés resulta mucho más fácil realizar investigación, ya sea identificación de organismos, clonación de proteínas de interés, entre muchos otros.

3 3 Cofactor QUÉ SE NECESITA PARA REALIZAR UNA PCR

4 Inicio solo es necesario de estarse usando una polimerasa que requiera activación por calor. Se lleva la reacción hasta una temperatura de 98 ºC durante 10 minutos (de ser una polimerasa termoestable) 94 o 96 ºC de no ser así. Desnaturalización Esta depende de cantidad de G+C y del largo.

5 Unión del cebador

6 Extensión o elongación de la cadena Dirección 5’ a 3’

7 Se repiten los pasos menos el de iniciación

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11 SECUENCIACIÓN DE SANGER Interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria durante una replicación in vitro. Síntesis catalizada por una DNA polimerasa, define carácter enzimático del método.

12 QUÉ SE NECESITA PARA LLEVARLA ACABO ADN hebra sencilla Primer o cebador. Desoxinucleótido Trifosfato (nucleótidos). Didesoxinucleótido Trifosfato. ADN polimerasa.

13 ENLACE FOSFODIESTER  Responsables del esqueleto del ADN y ARN.  También en fosfolípidos que son constituyentes de las bicapas lipídicas.

14 FORMACIÓN DEL ENLACE FOSFODIESTER Nucleótido1 Nucleótido 2 Tipo de enlace covalente que se produce entre un grupo hidroxilo en el carbono 3’ del azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato en el carbono 5’ del nucleótido entrante.

15 Desoxinucleótido Trifosfato Vs Didesoxinucleótido Trifosfato Análogos estructurales: provocan la detención de la reacción de síntesis de DNA 15 Poseen un grupo OH menos en la ribosa

16 16 SECUENCIACIÓN MANUAL

17 17 SECUENCIACIÓN MANUAL

18 Ejemplo Resultados Autoradiografía de gel de acrilamida 18

19 SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA DEL DNA Gracias al empleo de 4 fluorocromos diferentes, se pueden combinar las reacciones de los 4 ddNTPs en un solo tubo de reacción y aplicar la mezcla aun solo pozo del gel El color de cada banda corresponde al del ddNTP 3’- terminal de ese fragmento A medida que va transcurriendo la corrida electroforética, un detector va midiendo la presencia de las bandas que van pasando por el haz láser y su color Se genera un registro informatizado de los 4 perfiles de color, que combinados se interpretan como una secuencia ELECTROFEROGRAM A Se genera un registro informatizado de los 4 perfiles de color, que combinados se interpretan como una secuencia ELECTROFEROGRAM A * ** * 19