Aspectos Pre-Analíticos de las determinaciones Moleculares Dr. Javier Hernández Losa 24/02/2017

Generalidades Aspectos clave a tener en cuenta Puntos de mejora de las determinaciones moleculares

DEFINICION Según la norma UNE ISO 15189: 2007 se trata de aquellos procesos que comienzan cronológicamente a partir de la petición del médico clínico e incluyen la petición de los análisis, la preparación del paciente, la recogida de la muestra primaria y el transporte hasta el interior del laboratorio y terminan cuando comienza el procedimiento analítico.

Etapas de las determinaciones Moleculares Pre-Analíticos Post-Analíticos

Fuentes de Variabilidad en las determinaciones Moleculares Allred DC Mod Pathol 2010

Fragmentación de acidos nucleicos USO DE FORMOL TAMPONADO Ventajas Inconvenientes Barato Generación de vapores tóxicos Buen fijador único y gran capacidad de combinación con otros fijadores Transformación en acido fórmico por acción de la luz y oxígeno Velocidad de penetración intermedia Aparición pigmento formólico No retrae los tejidos Fragmentación de acidos nucleicos Buen desinfectante

Generalidades Aspectos clave a tener en cuenta Puntos de mejora de las determinaciones moleculares

Cortesía Dr. Rojo

Como afecta el tratamiento de la muestra a la extracción de ADN Sutherland BM et al (2000). Biochemistry 39, 8026 Brushov VI (2002) Nuc Acid Res 30, 1354 Finnegan MT (1995) Biochem Soc Trans 23, 4035 Cadet J et al (2005) Mutat. Res, 571, 3-17 Mandrioli M et al (2006) Entomol Exp App, 120.239 Lindahi T et al (1972) Biochemistry 11, 3610 and 3618

Tipos de muestras Biopsia Biopsia con aguja gruesa Pieza quirúrgica Citología (bloque celular) A B C D

Liquid Biopsy samples

¿Que tipo de extracción Adsorción en fase sólida de DNA uso? Quimica Nombre del Kit Empresa Material de partida Cantidad de ADN Tamaño del ADN Bolas Magneticas ChargeSwitch gDNA Invitrogen Sangre y tejidos <2 ug (50 ul de sangre completa) EZ1 DNA Tissue kit Qiagen Sangre, citologia, y tejidos 9-28 ug (10-40 mg de tejido) Qiasymphony Sangre, citologia, plasma y tejidos Genfind System Beckmann Coulter Sangre, plasma 7-12 ug (200 ul de Sangre completa) 40 kb MagAttract Blood DNA kit Sangre 0,4-1,2 ug (50 ul de sangre completa) MagneSil Blood Genomic Promega 4-6 ug (200 ul de Sangre completa) Salting out FlexiGene DNA kit Sangre, Leucocitos, cultivos celulares 11-14 ug (300 ul de Sangre completa) <150kb MasterPure DNA kit EPICENTRE Biotechnologies Todo tipo de muestras 3-9ug (200 ul de Sangre completa) PAXgene Blood DNA kit PreAnalytiX GmbH 150-500 ug (8,5 ml sangre completa) 50-150kb PureGene DNA kit Gentra Systems Sangre, Leucocitos, cultivos celulares, medula osea 15-50 ug/ml 100-200kb Wizard Genomic DNA Sangre, cultivos celulares, tejidos, bacteria 5-15 ug (300 ul Sangre completa) Adsorción en fase sólida ChargeSwitch direct gDNA Sangre, cultivos celulares 10 ul de Sangre GenElute Blood Genomic Sigma Aldrich Sangre. 4-10 ug (200 ul de Sangre completa) <50 kb Generation DNA kit Todos 3-8 ug (200 ul de Sangre completa) 23 Kb QIAamp DNA kit 4-12 ug(200 ul de Sangre completa) Wizard SV Genomic DNA Cultivos celulares y tejidos 20-30 ug (1,2 cm de tejido) Kits disponibles de extracción de DNA

Bolas Magnéticas Columnas Caotrópicas Menor cantidad ADN Mayor calidad No desparafinacion Mayor cantidad ADN Menor calidad Necesidad desparafinacion

Optimizar los protocolos en cada Laboratorio Tiempo de digestión Proteinasa K   48 Horas % 24 Horas > [10 ng/ul] 29 94 12 43 < [10 ng/ul] 2 6 16 57 Total 31 28 48Horas 24 Horas

Métodos de cuantificación de ADN

Cuantificación del ADN

Análisis de ADNds procedente de exosomas H20 MUESTRA CONTROL + Análisis de ADNds procedente de exosomas Cuantificaciones basadas en absorbancia no son exluyentes de seguir con la técnica molecular

¿Que significa Calidad del ADN?

Control de calidad del ADN 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 600 bp Material fresco Material fijado e incluido en parafina Formol no tamponado y Fijación prolongada

DETECCIÓN DE ADENOVIRUS • Desarrollo de primers específicos para el gen que codifica para la proteína Hexón. • Capaz de detectar 19 serotipos de adenovirus. • Tamaño del amplicón de 139 pares de bases. 139 pb Hexon Condiciones de PCR 94°C, 7 minutos. 94°C, 1 minuto 55°C, 1 minuto. 72°C, 1.5 minutos 72°C. 10 minutos 40 ciclos 139 pb H20 M1.1 C+ C- M1.2 Echevarria M et al. J.Clin.Microbiol.36:(11);3323-3326. 1998

PCR Multiplex • Se da una reacción simultanea de mas de una pareja de primers en la misma reaccion de PCR

Conocer efectos de los diferentes fijadores y control de tiempos REV ESP PATOL 2006; Vol 39, n.o 3: 175-179

EFECTOS DEL TIEMPO DE FIJACIÓN DE MUESTRAS REV ESP PATOL 2006; Vol 39, n.o 3: 175-179

ANALISIS DE REORDENAMIENTOS DE IGH JJM van Dongen et al. Leukemia (2003) 17, 2257–2317

Resultados de reordenamientos de IGH y TCR-Gamma. FR1 FR2 FR3 Policlonal Policlonal Policlonal Policlonal Clonal Policlonal Policlonal Policlonal

No Clonal vs No Valorable Analisis de muestra para el fragmento FR1 No Clonal vs No Valorable

Como se ve afectado el ARN??

Detección traslocación PAX3/PAX7-FKHR (Rhabdomiosarcoma Alveolar) CW-90-19 RH30 H2O PCR Genérica (PAX3/7) PCR Específica (PAX3)

Cortesía Dr. Rojo

Cortesía Dr. Rojo

Cortesía Dr. Rojo

Example: Exon 19 Deletion in EGFR by DNA Sequencing Del E746-A750 Example: Exon 19 Deletion in EGFR by DNA Sequencing Al 1 Al 2 ATTCGGATTACCATCGTA ATTCGGACATCGTA

Deleción del 19 en EGFR

Deleción del 19 en EGFR

Determinaciones mediante kit de DXS : Determinaciones mediante kit de DXS D Ct debe ser <1% D Ct Standard Requisitos previos: Muestra con un 70% de celulas tumorales Ausencia de inhibidores de PCR ( Control exogeno) Ct < 29 detecta 5% de ADN mutados Ct > 29 detecta mutaciones >5%

No Valorable Interpretación de resultados Rango de Ct +/- 2 ciclos Ct control 31-35 solo detecta mutaciones superiores al 5% Ct mutación > 38 repetir

Generalidades Aspectos clave a tener en cuenta Puntos de mejora de las determinaciones moleculares

Descalcificadores Failure in Bone Specimens EGFR 23% and FISH ALK 15%

Uso del kit Integrity Assay Integrity DNA Assay (especific 140 bp qPCR) Sample Name CT Mean 140 pb CT Mean 290 pb CT Mean 459 pb Quality of the DNA H2O Undetermined 13/819 27,15 26,55 29,2 High 13/1152 32,5 34 Low 13/1352 32,8 32,1 13/1366 25,1 24,7 27,2 13/1462 34,5 13/1632 31,45 31,1 32,35 Moderate 13/1767 29,9 33,5 13/2035 30,4 33 33,1 13/2357 25,8 25,15 26,3 13/2413 30,2 28,95 31,5 K562 23,5 23,1 22,55 13/2729 27,1 28,55 33,25 13/3334 30,45 30,37 14/292 26,75 25,6 26,9 14/587 32,85 35,19 14/630 28,4 26,95 14/763 25,26 24,43 25,7 14/1001 25,47 23,98 14/1137 30,55 31,7 35,2 High Moderate Low Quality of the DNA High: <29 Moderate: 29-32 Low: >32

Comparativa de métodos de decalcificación Unpublished data

Unpublished data Empleo de ácido cítrico DNA extraction with citric acid Conventional DNA extraction Nº Patient Nº DNA Extraction technique Decalcificator type PCR actina   1 16/5020 EZ1 Moldecal Yes 16/327 COBAS 16/5021 Decal ràpid - 16/328 3 16/5022 16/615 16/5023 16/330 4 16/5024 16/609 16/5025 16/610 Unpublished data

Trabajar en Zonas separadas. Material exclusivo de amplificación (puntas con filtro, guantes, pipetas) Uso de zonas esteriles. Minimizar Riesgos de Contaminación • Muy alta Sensibilidad. • Muy alta Especificidad Objetivos Finales

Fase Pre-analítica: Revisión del Patológo Evitar masas necróticas, Confirmar morfológicamente que el tejido analizado contiene células neoplásicas Estimar el porcentaje de células tumorales incluidas en la muestra Necesario para analizar los resultados moleculares No todas las técnicas aseguran resultados fiables con porcentajes de células tumorales bajos (secuenciación)

Fase Pre-analítica: Selección del material VH16B-1234 70% celularidad tumoral La muestra a analizar presenta un 70% de componente tumoral

RESUMEN ASPECTOS PRE-ANALITICOS Selección del material Por parte del patólogo Selección del método de extracción ADN Selección tecnica molecular adecuada Control Calidad de ADN/ARN Optimizar la cantidad ADN/ARN molde

Participar en Control Calidad internos y Externos

Muchas gracias por la atención