“TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN DE VEGETALES” Integrantes: Bernal de Montreuil, Daniella Mamani Benavente, Liliana Mercado Adrianzen, Jorge Tintaya Cortez, Karen Grupo 1 26 de Octubre de 2015

IMPORTANCIA Mejoramiento genético de tal manera que las células vegetales sean resistentes a enfermedades Potencialidades de producción Tamaño y color de frutos. En la actualidad, existen diferentes técnicas para aislar ADN total de especies vegetales. Extraer el ADN de plantas por método CTAB Grupo 1 26 de Octubre de 2015

METODO DE SHAWN CARLSON Fruta o verdura shampoo agua Isopropanol (frio) batidora sal centrifuga bicarbonato Matraces (500ml) Vasos de precipitado Probeta (500 ml) pipeta (5ml) Azul de metileno cuchillos Grupo 1 26 de Octubre de 2015

Método Preparación del tampón 240 mL agua+ 3g sal+10g bicarbonato+10mL shampoo Rompe membranascélula, núcleo Preparación del material biológico 3 veces de 10 s cada uno Libera su contenido Mezcla del “puré” con el tampón frio 5 mL triturado + 10 mL tampón frio centrifugación Separa materiales grandes 2 tubos por 5 min Recoger el sobrenadante Proteínas, pequeños orgánulos, ADN Y ARN 10 ml de isopropanol El ADN precipita en la interface Recoger ADN Añadir gotas de azul de metileno + enzima Destruye el ARN Grupo 1 26 de Octubre de 2015

METODO DE CTAB Materiales y método Concentrador de vacío Baño de incubación o termoblock Microcentrífuga Vortex Balanza analítica Cámara de electroforesis Agitador termo-magnético Potenciómetro Campana de extracción Ultracongelador Espectrofotómetro Grupo 1 26 de Octubre de 2015

Termo o cuba para nitrógeno líquido Tubos de microcentrifuga de 1.5 ml estériles Micropipetas de 2, 10, 200 y 1 000 uL Puntas para micropipeta de 10, 200 y 1 000 uL con filtro Morteros y pistilos Bisturí Espátulas Termómetro Hielo Grupo 1 26 de Octubre de 2015

•Agua destilada estéril libre de DNasas y RNasas •Alcohol isoamílico • 2-ß-Mercaptoethanol •Acetato de amonio •Ácido bórico •Ácido clorhídrico •Agarosa •Agua destilada estéril libre de DNasas y RNasas •Alcohol isoamílico •Cloroformo •Cloruro de sodio •CTAB, Bromuro de hexadecil trimetil amonio •EDTA Ácido etileno diamino tetracético di sódico • Etanol al 70% • Fenol • Marcador de peso molecular de 1 Kb • Nitrógeno líquido • Proteinasa K • RNAsa A • TBE (Tris base, EDTA, ácido bórico) • Tris base • Tris-Hidrochloride Buffer de extracción CTAB 2X 1.4 M de NaCl (8.181 g) 20 mM de EDTA (0.744 g), 2 % P/V de CTAB (2 g).Disolver lo anterior en 75 ml de buffer Tris-HCl 100 mM pH 8 en un agitador termomagnético hasta que las sustancias se disuelvan completamente. Agregar 300 µl de 2-β-mercaptoetanol en la campana de extracción ya que este compuesto es muy volátil y tóxico. Finalmente, aforar a un volumen de 100 ml con la solución de Tris-HCl previamente utilizada. Mantener a temperatura ambiente y antes de iniciar el proceso caliente a 55 °C. Grupo 1 26 de Octubre de 2015

Procedimiento Grupo 1 26 de Octubre de 2015

Fundamento de la técnica En este método, el detergente (CTAB) contenido en el tampón de extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la composición de los lípidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampón de extracción captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear. EDTA forma un complejo con los iones de Mg2+. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daña el ADN). El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. como el acetato de amonio o el acetato sódico. Grupo 1 26 de Octubre de 2015

VENTAJAS Y DESVENTAJAS El CTAB es mas usado dado que desde su aparición se pudieron realizar modificaciones para trabajar con diferente analítos vegetales. Permite obtener el mayor promedio de concentraciones. No solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Con el protocolo de Shawn Carlson la eficiencia no es mucha. Grupo 1 26 de Octubre de 2015

CONCLUSIONES Al extraer el ADN de plantas por método CTAB, es decir, la inclusión de este detergente simplificó y redujo el tiempo el tiempo empleado, en vez de utilizar el detergente SDS. Grupo 1 26 de Octubre de 2015

BIBLIOGRAFIA http://gmo.crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf. http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0375-07602004000 300010&script=sci_arttext. www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf Grupo 1 26 de Octubre de 2015