AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS.

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1 AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

2 Estructura del ADN James Watson y Francis Crick en demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

3 El ADN es un ácido nucleico formado por nucleótidos.
Cada nucleótido consta de tres elementos: Un azúcar: desoxirribosa Un grupo fosfato Una base nitrogenada (adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)) Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’–OH (hidroxilo) en la desoxirribosa

4 Características de los plásmidos
Se replican independientemente del cromosoma del hospedero Portan SOLO genes no esenciales Pueden ser circulares o lineales, de 1 kbp hasta de 1 Mbp Se encuentran superenrrollados, que es la forma más compacta que existe de DNA Se pueden encontrar desde 1 a 3 copias por célula o hasta 100.

5 Conformaciones de un plásmido
Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

6 Superenrollamiento plásmido
Existen varias conformaciones de los plásmidos en el estado superenrollado. Por lo que pueden migrar en un campo eléctrico de manera muy diferente cada uno a pesar de tener el mismo peso molecular

7 Hay distintos procedimientos para la purificación de DNA plasmídico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes: Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plásmido. Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido  Purificación del DNA plasmídico

8 DESNATURALIZACIÓN ALCALINA O METODO de lisis alcalina de Birnboim y Doly Este método se basa en la diferente resistencia a valores de pH elevados del ADN plasmídico y cromosómico. Explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico y el DNA cromosómico.

9 Desnaturalización La alcalinización con NaOH en presencia de un SDS, provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y la liberación de los plásmidos también desnaturalizados.

10 Renaturalización La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca: A) que se cierre covalentemente el DNA plasmídico B) y la precipitación del DNA cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias).

11 Los agregados insolubles de DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa El ADN plasmídico en el sobrenadante se concentra por precipitación con etanol.

12 Los tres pasos para obtener el DNA plasmídico

13 En la práctica: Inocular 5mL de célulass transformantes en 5mL de medio LB+Kanamicina e incubar a 37◦C durante 12 h aprox. Centrifugar el medio a 10000rpm por 1min a 4◦C y descartar el sobrenadante. El paquete celular queda en un microtubo. Resuspender en 300µL de soln GTE fría, agitar en vortex e incubar a Tamb por 5min.

14 Adicionar 300µL de soln de lisis (que contiene
Adicionar 300µL de soln de lisis (que contiene?) , mezclar por inversión e incubar en hielo por 5min. Adicionar 300µL de soln fría de acetato de potasio (3M,pH=4.8) y mezcla por inversión e incubar en hielo por 5min.

15 Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C.
Transferir sobrenadante a un tubo, adicionar volumen igual de isopropanol frío e incubar por 20min a -20◦C. Eliminar sobrenadante y lavar con 1mL de etanol al 70%. Centrifugar a rpm por 5min a 4◦C Decantar sobrenadante y eliminar sobrante por evaporación a Tamb.

16 Resuspender con 30µL de agua estéril y guardar a -20◦C.
Cuantificar concentración mediante absorbancia a 260nm (considerar unidad de absorbancia=50µg/mL).

17 Bibliografia Cercenado Emilia, Procedimientos en Microbiología Clínica “ Métodos moleculares de tipificación epidemiológica en bacteriología”, SEIMC, %20metodos%20moleculares%20de%20tipificacion%20epi demiologica.pdf