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GALACTOSEMIA Química Biológica Patológica Dra. Silvia Varas Tema:9 (Bolilla 9)

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1 GALACTOSEMIA Química Biológica Patológica Dra. Silvia Varas Tema:9 (Bolilla 9)

2 TEMA 9: Galactosemia. Manifestaciones clínicas. Metabolismo de la galactosa en la galactosemia. Defectos enzimáticos. Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención. Detección de portadores. Fructosuria. Metabolismo de la fructosa. Fructosuria esencial. Intolerancia hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico. Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.

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4 Origen de Galactosa Leche Ligada con enlaces tipo en ciertas legumbres, verduras y frutas. En forma de galactocerebrósidos y gangliósidos en algunas vísceras de animales

5 Absorción de Gal SGLT1 GLUT 2 GLUT 5 Familia SGLT Sodium- dependent glucose cotransporters, symporter

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7 GLUCEMIA SANGRE Glucosa-6-Fosfatasa Via de las Pentosas D-Ribosa-5-P +NADPH + CO 2 Glucosa-6- Deshidrogenasa Via Glicolitica Piruvato Acetil CoA Ciclo Krebs CO2+ H2O 80% Vía Glitica 20% Gp y Gl

8 (1906–1987), Premio Nóbel, 1970

9 por su descubrimiento de los nucleótidos de azúcar y su rol en la biosíntesis de carbohidratos Papel de los UDP- azucares: en los mamíferos, la mayoría de los grupos glucosilos son donados por UDP-azúcares

10 Metabolismo Normal Galactosa: Vía Leloir

11 galactitol Desarrollo de cataratas Aldosa Reductasa (AR) galactonato Vía de las Pentosas Galactosa Deshidrogenasa (GDH) UDP-GalDieta -D-galactosa Gal-1-P Glu-1-P UDP-Glu Vía Glicolítica GALK GALT GALE ATP ADP UGP (Pirofosforilasa) (3) (4) UTP PPi UGP (Pirofosforilasa) + UTP (1) (2) IMPasa Acido D-Galactónico Acido -ceto-D-Galactónico D-Xilulosa D-Xilulosa Fosfato Via de las Pentosas Fosfato CO2

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13 VIAS ALTERNATIVAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA Reducción a galactitol Oxidación a galactonato La vía de la pirofosforilasa y bypass a GALT

14 UDP-GalDieta -D-galactosa Glu-1-P UDP-Glu Vía Glicolítica GALK GALT GALE ATP ADP Producción Endógena de Galactosa Gal-1-P UGP (UTP-glucosa/galactosa Pirofosforilasa) (1) (2) (3) IMPasa UTP + Agregar a la pagina 13 del apunte

15 DESORDENES HEREDITARIOS DEL METABOLISMO GALACTOSA Galactoquinasa (GALK) Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE)

16 Galactoquinasa (GALK) El gen GALK1 se encuentra en el brazo largo (q) del cromosoma 17 en la posición 24 La enzima se expresa en hígado, GR, leucocitos, fibroblastos, placenta y varios tejidos fetales y adultos en humanos El dominio N terminal de la enzima monomerica se muestra en azul y el dominio C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo donde se une galactosa y fosfato inorgánico

17 Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) El gen que codifica GALT esta localizado en el cromosoma 9p13 y tiene una extensión de 4,3Kb, constituido por 11 exones. Las dos subunidades del dímero de la enzima se muestran en color rojo y azul. Se indica la posición de los metales en formas de esferas. En el sitio activo de la enzima se encuentra unido UDPglucosa. Tiene regulación dietaria y hormonal Se expresa en hígado, ID, ovarios, cerebro, fibroblastos y eritrocitos

18 Exón: Tamaño (nt) 5 3 4,3 Kb Proteína: 379 aminoácidos Gen GALT

19 Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE) El gen GALE mapea en el cromosoma 1p36. El gen incluye 12 exones que se extienden alrededor de 4 kb de ADN genómico Cada subunidad de la enzima dimerica se plega en dos dominios. Los dominios N y C terminal están en color azul y rojo, respectivamente. Unido al sitio activo NADH y UDP- glucosa. La enzima se expresa en hígado, mucosa intestinal, fibroblastos, eritrocitos.

20 Biología Molecular Galactoquinasa Al menos 25 mutaciones diferentes han sido identificados en los lugares de GALK galactocinasa en pacientes. Frecuencia: 1/ La enzima humana incluye 392 aminoácidos con una masa molecular de 42 kDa Algunas de las mutaciones son: 1569CT en el exón 2 (R68C), 7093CT en el exón 6 (T 288M), 7538GC en el exón 8 (A384P) y una deleción de un par de bases en el exón 5 (2833del C).

21 Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa Las 6 mutaciones más comunes p.Q188R, p.S135L, p.K285N, p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el 80% de los casos de galactosemia clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2 AG ha sido descrita en la población hispana. Mutación N314D: Variantes

22 Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa Frecuencia Galactosemia Clásica: 1: Deficiencias Parciales: 1:14.623

23 VARIANTES ALELICAS DE GALT

24 La variante Duarte es un alelo polimorfico del gen GALT que resulta en actividad alterada de la enzima. Este polimorfismo común en la población es sin signos clínicos o síntomas

25 Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación N314D esta asociada con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada pero con fenotipos subclínicos diferentes. Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con aumento de la actividad de GALT ( % de lo normal) N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT). La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7 Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con aumento de la actividad de GALT ( % de lo normal) N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT). La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7 Duarte-2 (D2) Esta asociado con disminución de la actividad de GALT El polimorfismo N314D es un ligamiento en desequilibrio con 3 sustituciones intrónicas (IVS 4nt-27gc; IVS 5nt- 24ga y IVS 5nt+62ga) y una deleción de 4pb en el promotor de GALT La frecuencia de los alelos D2 es de 5,1

26 El Alelo Duarte puede tener significancia clínica con otras mutaciones en el gen GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo Duarte/Galactosemia). La combinación de una mutación clásica (G) y la variante D muestra una disminución de la actividad de GALT pero no resulta típicamente en los síntomas de galactosemia clásica

27 Tabla II: Diagnostico de sospecha de la Galactosemia I-Clínica de sospechaII- Bioquímica InespecíficaIII- Bioquímica Específica A- Síntomas Tóxicos Vómitos Rechazo del alimento Depresión neurológica A- Disfunción Hepática Hiperbilirrubinemia Hipoalbuminemia Déficit complejo protrombina GOT, GPT, GGT, LDH Acidos Biliares plasmáticos. Hipoglucemia A-Galactosuria B- Afectación oftalmo- lógica. Cataratas B- Tubulopatía proximal renal Acidosis hiperclorémica Glucosuria Aminoaciduria Albuminuria B- Aumento de galactosa en plasma C- Fracaso hepático grave Ictericia Hepato-esplenomegalia Ascitis Diátesis hemorrágica C- Aumento de Gal-1-P en eritrocitos D- Tubulopatía proximalD- Galactitol en plasma y orina E- Déficit Inmunitario Sepsis E. coli

28 Diagnostico Bioquímico Determinación de metabolitos Determinación de actividad enzimática

29 Determinación de metabolitos: Galactosa en Orina Gal-1-P en eritrocitos Gal TOTAL en eritrocitos Tabla VIII: Resumen de los niveles de metabolitos DeficienciaGalactosa (Plasma u Orina) Gal-1-P (sangre) GALKElevadaNormal GALTElevada GALENormal - ElevadaElevada

30 Galactosa en Orina: Pesquisa Neonatal Galactosa + O 2 Ac.Galactónico + H 2 O 2 H 2 O 2 + Cromógeno Cromógeno oxidado + H 2 O Galactosa oxidasa Peroxidasa Los valores normales en RN: hasta 60mg/dl de orina

31 Galactosuria Cuantitativa D- Galactosa es oxidada a D-galactonolactona (que en un medio alcalino se hidroliza espontáneamente) en presencia de la enzima galactosa deshidrogenasa (EC ). La formación de NADH es medido en un intervalo de 10, por incremento en la absorbancia a 340nm que es proporcional a la cantidad de D-Galactosa en la muestra.

32 Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal (1º)

33 Determinación Enzimática Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) en eritrocitos

34 Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferase (GALT), en Sangre Hemolizado de GR

35 Ausencia NADPH – No hay decoloración del Azul de Metileno NADPH actividad de GALT rapidez de decoloración de AM

36 Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido I Usado por ABA Lab. Dr. Gustavo Borrajo

37 Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido II UMTEST GAL de SUMA:usado en CSSL

38 Análisis Molecular: Detección de Mutaciones por amplificación por PCR+ER

39 En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de 1: recién nacidos. Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de restricción HpaI. El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 256pb. N314D, Duarte variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava II El alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 166pb. S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5. El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 252pb. Mutación Q188R Mutación N314D Mutación S135L

40 After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using the enzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5. (A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane 1, mutated homozygous (referred case); lanes 2 and 3, heterozygous (two screened cases) and lanes 4–10, homozygous wild-type allele. (B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane 4, homozygous mutated allele (referred case); lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7– 10, homozygous wild-type allele

41

42 ?? Duarte 2 homocigota, DG??

43 Diciembre 2010 con un total de RN 15 pacientes con Galactosemias Clásicas (Frecuencia 1:42.894), 44 pacientes con Deficiencias Parciales de GAL-T (Frecuencia 1:14.623), 3 pacientes con Deficiencias de GAL-K (Frecuencia 1: ) y 2 pacientes con Deficiencias de GAL-E (Frecuencia 1: ). Gracias al Dr. Gustavo Borrajo por la casuística !

44 Etiología Incidencia global: 1/50.000

45 Patogenia I La deficiencia de GALK impide la fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo que supone un acúmulo de galactosa en sangre, y la consiguiente producción de galactonato y galactitol El acúmulo de galactitol produce edema de las fibras del cristalino, y una desnaturalización de las proteínas, responsable del desarrollo de la catarata.

46 Aumento de Galactitol Catarata nuclear en gota de aceite que puede tener un inicio intrauterino, en casos excepcionales

47 Patogenia II El déficit GALT se produce un aumento de Gal-1-P eritrocitaria y de la galactosa plasmática con la consiguiente galactosuria La galactosa en exceso en el plasma es convertida en galactonato, y en galactitol.

48 Patogenia II: Metabolitos tóxicos Gal-1-P: ATP y Pi AMPdeaminasa Ac. Urico; inhibición de enzimas Balance UDP-Gal / UDP-Glu Defectos en la glicosilación

49 Patogenia III En el déficit GALE se produce un acúmulo de UDPGal e incluso de Gal-1-P Hay un déficit en la síntesis endógena de galactosa y en la producción de galactolípidos y galactoproteínas

50 Tratamiento La galactosa de la dieta debe ser eliminada ante la menor sospecha La ingesta diaria no debería contener nunca más de 125 mg de galactosa (frente a los mg que por término medio tiene una dieta de un adulto normal); Una dieta estricta contiene aproximadamente unos 40 mg

51 Alimentos lácteos La leche y todos sus derivados son la principal fuente de galactosa liberada en el intestino mediante hidrólisis de la lactosa; y por tanto deben ser excluidos de la dieta en cualquiera de sus formas. La caseína es probablemente también una fuente importante de galactosa libre, ya que 100 gr. aportan 184 mg, y una fórmula láctea cuyas proteínas sean un hidrolizado de caseína, puede llegar a tener mg por litro.

52 Tabla IV: Contenidos aproximados en galactosa soluble de algunos alimentos (mg/100 gr de alimentos) Menos de 5 mg Melón, uva, pomelo, naranja, fresas Espárragos, remolacha, repollo, coliflor, apio, pepino, berenjena, espinaca, lechuga y maíz. Entre 5-10 mg Manzana, banana, pera. Brócoli, zanahoria, cebolla, nabo. Entre mg Kivi, sandia, piña. Col de Bruselas, calabazas, sandia, batata. Entre mg Arándano Tomate Entre mg Soja, alubias Más de 100 mg Lentejas, guisantes, porotos Más de 400 mg Higos secos, pasas, avellanas Garbanzos

53 Control del tratamiento: Los marcadores utilizados para el seguimiento del tratamiento dietético son los niveles de Galactosa-1-P eritrocitarios, y galactitol plasmático. Valores de 4 mg % de Gal-1-P, y de mol/L de galactitol plasmático (mg/dl =38 x mol/L), es lo máximo que puedan aceptarse como buenos

54 Gal 20 o GALT 40? GALT 40? Gal-1-P25%? Si No Positivo: Posible Deficiencia GALT Positivo: Posible Deficiencia GALK Positivo: Posible Deficiencia GALE Si No Si Unidades: Galactosa mg/dl y GALT mol/L Posible ausencia de Galactosemia

55 Resultado Pesquisa Neonatal gal y enzima GALT o gal y GALT: N GALT< 1% Gal-1-P GALT 1-10% Gal-1-P GALT 10-75% N/ Gal-1-P GALT: N Gal Gal-1-P: N Mutación GALT presente Galactitol GALT: N Gal-1-P Galactitol Galactitol Normal Galactosemia Clásica Variante de Galactosemia Variante/ Galactosemia Benigna o Portador Actividad GALK Actividad GALE Deficiencia GALK Deficiencia GALE Falso Positivo

56 Bibliografía: - Baldellou A.; Briones P. y Ruiz M. AECOM: Asociación Española para Estudio de Errores Congénitos del Metabolismo: Protocolo 9: Galactosemia. Protocolo de diagnóstico y tratamiento de los errores congénitos del metabolismo de la galactosa - Segal SS ; Berry GT. Disorders of Galactose Metabolism. En Scriver CR, Beaudet AL, Sly W S, Valle D (eds). The metabolic and molecular bases of inherited disease. New York, McGraw Hill, 2001; pag Annet M. Bosch. Classical galactosaemia revisited. J Inherit Metab Dis (2006) 29:516–525 - J. DíazRuiz, A.CordónMartínez,J.LópezLópezyA.JuradoOrtiz. Galactosemia. An Pediatr (Barc) JM Flanagan, G McMahon, SH Brendan Chia, P Fitzpatrick, O Tighe, C ONeill, P Briones, L Gort, L Kozak, A Magee, E Naughten1, B Radomyska, M Schwartz, JS Shin, WM Strobl, LA Tyfield, HR Waterham, H Russell, G Bertorelle, JKV Reichardt, PD Mayne and DT Croke The role of human demographic history in determining the distribution and frequency of transferase-deficient galactosaemia mutations. Heredity 104, 148–154 - Amanda E. Carney, Rebecca D. Sanders, Kerry R. Garza, Lee Anne McGaha, Lora J. H. Bean, Bradford W. Coffee, James W. Thomas, David J. Cutler,Natalie L. Kurtkaya and Judith L. Fridovich-Keil. Origins, distribution and expression of the Duarte-2 (D2) allele of galactose-1-phosphate uridylyltransferase. Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No. 9 - Mohamed Jama, Lesa Nelson, Rong Mao and Elaine Lyon. Simultaneous Amplification, Detection, and Analysis of Common Mutations in the Galactose-1- Phosphate Uridyl Transferase Gene.J Mol Diagn 2007, 9:618– Suzuki, M., West, C. and Beutler, E. (2001) Large-scale molecular screening for galactosemia alleles in a pan-ethnic population. Hum. Genet., 109, 210–215.

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