PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS INMUNOLOGIA 2009 Dra. Virginia Bolaños de Corzo Departamento de Microbiología FMVZ - USAC

PRUEBAS DE AGLUTINACION Método rápido y sencillo usado ampliamente para identificar: virus, bacterias, grupos sanguíneos. Cuando se usan antigenos conocidos se detectan anticuerpos específicos. Los antigenos que se utilizan se encuentran en suspensión. La IgM es la mas eficiente aglutinando.

PRUEBAS DE AGLUTINACION Los anticuerpos establecen uniones cruzadas con los antigenos, lo que se visualiza como ¨grumos¨. Las partículas de antigeno poseen carga negativa. (Potencial Zeta). Los anticuerpos poseen carga positiva. Es necesario que exista una concentración salina para favorecer la reacción. Fenomeno de Prozona: cuando existe un exceso de anticuerpos, se inhibe la aglutinación.

PRUEBAS DE AGLUTINACION VENTAJAS Muy utilizadas. Sencillas. Rápidas. Cuali o cuantitativas Económicas DESVENTAJAS Muy sensibles. Reacciones hetero- especificas.

Prueba de aglutinacion

Pruebas de Precipitación Se realizan en medios líquidos y en medios semisólidos. Debe existir equivalencia entre ambos reactivos: antigeno y anticuerpo. En medios líquidos se mezclan ambos componentes, dejando reposar y se formara un anillo en la interfase de los líquidos. Prueba de Ascoli para Antrax.

Pruebas de Precipitación. Los medios semisólidos se usan para inmunodifusion o inmunoeletroforesis. Se basa en el hecho de que de que la mayoría de las proteínas se difunden a través de un gel. Al contactarse antigenos y anticuerpos específicos se forma una banda de precipitación en el punto en que ambos alcanzan equivalencia.

La prueba de Coggins (Anemia infecciosa equina) es un ejemplo de inmunodifusion doble. Enfermedades que se diagnostican por esta prueba: leucosis bovina, Influenza aviar, lengua azul, virus de artritis encefalitis caprina (cae).

PRUEBAS DE PRECIPITACION VENTAJAS Existen varias pruebas. Se observan fácilmente. Muy útiles. No se requiere equipo costoso. Pueden ser cuali o cuantitativas DESVENTAJAS Poseen baja sensibilidad.

Prueba de Inmunodifusion

INMUNOELECTROFORESIS Son pruebas que combinan la electroforesis con reacciones de antigeno-anticuerpo. Inmunoelectroforesis en agar. El antigeno se coloca en el medio. Se separa por electroforesis. Se agrega suero hiperinmune. Al unirse antigeno y anticuerpo se forman líneas de precipitación.

PRUEBAS DE HEMOAGLUTINACION Algunos virus tienen la propiedad de aglutinar eritrocitos de mamíferos o aves permitiendo identificarlos y cuantificarlos. Grupos virales: orto y paramixovirus, alfa y flavirus, coronavirus. Mycoplasma gallisepticum. La hemoaglutinación ocurre cuando la hemoaglutinina actúa de manera reciproca con un receptor especifico en la superficie del eritrocito.

P. DE HEMOAGLUTINACION La glucoproteina sirve como el sitio de recepción para la hemoaglutinina y como sustrato para la neuraminidasa viral. Las HA del virus se unen a los G.R. formando agrupaciones que se visualizan como aglutinación.

Prueba de HA Puede ser cuali o cuantitativa. La ultima dilución que presenta aglutinación se toma como el titulo, el cual se expresa en unidades aglutinantes = 1 DHA Es importante considerar: concentración de sales, Ph, temperatura.

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION HI Los anticuerpos contra los virus hemoaglutinantes inhiben la hemaglutinacion al bloquear los lugares de unión. Esta prueba se usa para: Identificar el virus. Para medir concentraciones de Ab.

PRUEBA DE HI Titulo: mas alta dilución que Inhibe la Hemaglutinacion por el No. de DHA Para la interpretación considerar: Método y vía de vacunación. Tipo de vacuna. Edad y fecha de vacunación. Enfermedades inmunosupresoras.

Prueba de HI

Anticuerpos fluorescentes Estas técnicas utilizan normalmente cultivos celulares (primarios o de líneas estables) infectados con el virus o la bacteria sobre la que se desea comprobar si hay o no anticuerpos en el suero problema. Tras la incubación con el suero problema;). La unión se visualiza tras la adición de un conjugado anti-inmunoglobulina marcado con isocianato o con peroxidasa y la posterior observación al microscopio de fluorescencia o convencional respectivamente.

Reacción de fijación de complemento Esta reacción sigue siendo el método de elección para el diagnostico indirecto de enfermedades infecciosas importantes en veterinaria: brucelosis, paratuberculosis. Posee alta especificidad y sensibilidad. La prueba se basa en que los complejos antigeno-anticuerpo, fijan el complemento, se impide que este se una a un sistema indicador

Que consiste en glóbulos rojos de ovino, recubiertos de anticuerpos antihematies. El consumo in vitro del complemento en la primera etapa por la unión-antigeno anticuerpo, evitara que los glóbulos rojos sean lisados (prueba positiva), sin embargo si se observa hemólisis revelará la *fijación* del complemento a este segundo inmunocomplejo, lo que demuestra la ausencia de anticuerpos específicos al antigeno de la primera fase.

Seroneutralizacion Este método está considerado de referencia para cualquier estudio serológico pues es el que más se correlaciona entre la respuesta "in vitro" y la respuesta "in vivo". En esta prueba se puede valorar la capacidad que tienen los anticuerpos presentes en un suero problema para neutralizar la actividad biológica de un antígeno. 

Prueba de Neutralización Son altamente sensibles y especificas. Se pueden realizar en 2 vías: La concentración viral se mantiene constante y el suero diluido. El suero se mantiene constante y el antigeno diluido. Se podrá determinar la capacidad neutralizante del suero o del antigeno.

Seroneutralizacion La valoración biológica de la efectividad del proceso se puede realizar sobre cultivos celulares o animales de laboratorio.

Pruebas de Protección. Son similares a las de neutralización solo que se realizan por completo in vivo. La capacidad de proteccion que posee un suero puede ser valorada mediante su inoculacion en diluciones seriadas en un grupo de animales de laboratorio, para luego desafiarlo con el antigeno.

El valor de protección de los sueros se expresa como Dosis Protectiva 50% (DP50%). El calculo se realiza mediante pruebas estadísticas como Reed y Muench.