PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MICROBIOLOGÍA Raúl Gil Orts MIR 2 Análisis Clínicos

INDICE INTRODUCCIÓN TINCIONES CULTIVOS TÉCNICAS DIRECTAS MÉTODOS MOLECULARES MALDI-TOF TÉCNICAS FUTURAS

INTRODUCCIÓN -Procesos manuales Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los mismos en las muestras. Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado - Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no crece en los medios de cultivo. - Los resultados no se ven alterados por la administración previa de antimicrobianos. - Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los antimicrobianos

TINCIÓN Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente - Morfología microscópica y características tintoriales Tinción Aplicación Resultados Comentarios Gram Diagnóstico presuntivo, sobre todo en neumonía y meningitis bacteriana Deteccíón de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes Requiere experiencia; Puede diferenciar levaduras Azul de metileno Gránulos metacromáticos de corinebacterias Morfología general y seleccionada Corynebacterium diphteriae Wright-Giemsa LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo Morfología general de las estructuras celulares Permite visualizar bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones virales

Tinción Tinción Aplicación Resultados Comentarios Ziehl-Neelsen Kinyoun Muestras (ESP, LBA, LCR, orina, etc) para identificar BAAR y diferenciar de actinomicetales BAAR muestran un color rojo granate, sobre fondo azul, permite detectar también parásitos como Cryptosporidium y Ciclospora Las micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias son bacilos arboriformes y ramificados Microscopía de campo oscuro Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria Se ven espiroquetas móviles Requiere experiencia Tinta china Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Crytococcus Cryptococcus posee una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras

Tinción Tinción Aplicación Resultados comentarios KOH 10% Examen directo de las extensiones de piel, pelos y uñas para ver dermatofitos Visualiza elementos fúngicos Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización Blanco Calcoflúor Examen LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias. Requiere M. Fluoresc. Auramina-rodamina Útil para la búsqueda de BAAR en una variedad de muestras clínicas. Extensiones concentradas de sedimentos de micobacterias Tinción preferida para BAAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestras

TINCIÓN GRAM neumococo

TINCIÓN GRAM Exudado uretral: LCR: Neisseria meningitidis Neisseria gonorrea LCR: Neisseria meningitidis

TINCIÓN Blanco calcoflúor Candida albicans

TINCIÓN Auramina Zhiel-Neelssen

TINCIÓN Tinta China Cryptococcus neoformans

Repartidos 2 tubos Eppendorf CULTIVOS BACTERIANOS Nivel Hemocultivos - Forma tradicional - Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas) - Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-48h) - Técnica rápida - Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo Extraer 10 ml de sangre Centrifugar 3 ml sobrenadante Repartidos 2 tubos Eppendorf 13000 rpm 1 min Centrifugar 1500 rpm 5 min IDENTIFICACIÓN - 3-4h ANTIBIOGRAMA – 6-12h SEDIMENTO - LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL

TÉCNICAS DIRECTAS Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR) mínima manipulación reducen el tiempo del proceso analítico -También denominadas “point-of -care test“ Beneficio: Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor tiempo mejor evolución enfermedad técnicas : Inmunocromatografía Enzimoinmunoanálisis Inmunofluoerescencia indirecta - PCR a tiempo real

TÉCNICAS DIRECTAS Test/Microorganismo Muestra Técnica S E Antígeno neumococo Orina, LCR, LPL ICT 66-70 90-100 Antígeno legionella Orina 76 99 Plasmodium Sangre 87-100 52-100 S. pyogenes Frotis faríngeo EIA 53-99 62-100 Antígeno VRS Frotis nasofaríngeo 59-97 75-100 Antígeno rotavirus Heces 75-99 95 S. aureus (MRSA) S. agalactiae Enterovirus Frotis nasal Frotis vaginal LCR PCR t.r. 86-94 94-97 97 93-95 96-100 100 VIH 99-100

TÉCNICAS DIRECTAS Microorganismo Muestra Técnica Haemophilus influenzae Muestra respiratoria Líquido pleural LA Virus gripe A y B Moco nasofaríngeo Exudados nasal y faríngeo IFI, ICT, EIA Metaneumovirus IFI Virus parainfluenza 1, 2, 3 Adenovirus IFI, ICT

TÉCNICAS DIRECTAS Antígeno neumococo Antígeno legionella Plasmodium Antígeno VRS

TÉCNICAS DIRECTAS S. pyogenes Rotavirus Toxina C. difficile Entamoeba hystolitica EIA

MÉTODOS MOLECULARES PNA-FISH - peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization - Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los microorganismos. - Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli, Enterococcus spp, Ps. Aruginosa o fungemias por Candida spp. En aproximadamente 3 horas

Métodos moleculares PNA-FISH Ps. aeruginosa S. aureus

MÉTODOS MOLECULARES PCR en tiempo real - Modificación de PCR convencional - Mejora la rapidez en la detección - Mejora en Sensibilidad y Especificidad - Detecta a la vez que amplifica - Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con el empleo de geles agarosa - Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95% - Tiempo de ejecución 1.5 horas

MÉTODOS MOLECULARES PCR a tiempo real - Test comercializados: - Detección MRSA en frotis nasales - Detección Enterococcus spp. resistentes a glucopéptidos en frotis rectales - Clostridium difficile en heces - S. agalactiae en frotis vaginal y rectal en embarazadas - Enterovirus en LCR - Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C

MÉTODOS MOLECULARES PCR t.r. Detección: - S. aureus resistente a meticilina - Clostridium difficile - Enterovirus en LCR - S. agalactiae

MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight - Se describió hace 30 años Se diseñó para analizar biomoléculas uso reciente para la identificación de microorganismos Técnica: Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la energía emitida las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son sometidas a una aceleración en un campo eléctrico son separadas según masa y carga hasta que llegan a un detector el perfil de proteínas generado se compara con una base de datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación

MALDI-TOF Ventajas: - Rapidez - más barato que sistemas habituales - puede identificar la mayoría de microorganismos habituales Uso: -para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias - puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos - puede detectar proteínas concretas - proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así staphylcoccus resistentes a oxacilina.

Técnicas futuras Multiplex PCR tiempo real Técnica Septifast de Roche. Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos frecuentes. Aún no comercializado Secuencición del ADN: pirosecuenciación Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato liberado durante la síntesis de ADN Permite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado: - genotipado de bacerias y virus - reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH - caracterizar bacterias resistentes a antibióticos

Técnicas futuras Sistema StaphPlex Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que permiten identificar : -a nivel de especie diferentes estafilococos - identificar resistencia a antibióticos más utilizados

GRACIAS