ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados La secuencia de una proteína es similar entre especies pero no es idéntica Las proteínas han evolucionado mediante cambios en sus secuencias de aminoácidos. Algunos cambios son conservadores y otros no conservadores

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UNA PROTEÍNA: SECUENCIACIÓN 1953: Sanger secuenció la insulina Método experimental 1ª Fase: Determinar la composición de aa Hidrólisis ácida Cromatografía (Actualmente existen secuenciadores automáticos) 2ª Fase: Identificar el aa N-terminal Marcar el aa N-terminal 1-fluor-2,4 dinitrobenceno (DNF) (der. amarillo) Cloruro de dansilo (ClDNS) (Der. Fluorescente) Hidrólisis del péptido Separación de aa (electroforesis, cromatografía) Identificación del aa marcado

Identificación del residuo C-terminal Hidrazina (NH2-NH2): rompe enlaces peptídicos y forma derivados de hidrazina con todos los aa excepto el C-terminal Carboxipeptidasa A: hidroliza el último enlace peptídico 3ª Fase: Degradación de EDMAN Marcar el aa N-terminal con fenilisotiocianato (PITC) en medio alcalino (se forma el derivado feniltiocarbanilo) Se hidroliza el enlace peptídico entre los residuos 1 y 2 (medio ácido anhidro fuerte) Se identifica el derivado del residuo N-terminal por HPLC El resto del polipéptido sigue intacto por lo que puede repetirse el proceso para determinar el 2º aminoácido Por repetición continuada puede secuenciarse el polipéptido desde el extremo N-terminal

Reactivos para identificar NH2 terminales 2,4-dinitrofluorbenceno FDNB Sanger Después de la hidrólisis Amarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis ionizados no se extraen) DNS-Cl Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo Cloruro de dansilo Después de la hidrólisis Análogo a FDNB pero fluorescente (detecta cantidades mínimas)

Reactivos para identificar COOH terminales Hidrazinolisis NH2-NH2 Después de la hidrólisis El terminal queda libre y los demás como hidracidas NH2-NH2

DEGRADACIÓN DE EDMAN Marcaje 1ª vuelta Liberación 2ª vuelta “Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003

SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002