Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé, PhD Mapas de Restricción Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé, PhD

Objetivos Al completar este ejercicio los estudiantes 1. Habrán usado enzimas para digerir un plásmido 2. Analizaran los resultados con una electroforesis de agarosa. 3. Calcularán las distancias entre los puntos de corte de las enzimas usadas 3. Determinarán las posiciones relativas entre estos cortes

Análisis Plasmido de 5000bp Enzimas ABC Cualquiera sola 5000bp La localizacion de lugares de restriccion es importante en: Analisis Mapas y Cloning De moleculas de DNA Su Plasmido de 5000bp Enzimas ABC Cualquiera sola 5000bp Double Digest AC – 3000, 2000 AB – 4500, 500 BC – 3,500, 1500 Plasmido de 5000bp Enzimas ABC – 3000, 2500, 500

Interpretacion de mapas

Digestiones parciales y Configuraciones Supercoiled migran ++++ Lineal +++ Nicked ++ Dimeros + Trimeros .+

Marcadores En este expto determinaras las localizaciones de sitios de restriccion en el plasmido. Se usaran fragmentos para el tamano

Reactivos Las enzimas con HindIII y Bgl 1 Asume a Bgl1 en 0 Calcula las distancias entre los puntos de corte y determina las orientaciones relativas.

Instrucciones Generales Anadir enzimas, mezclas de reaccion al DNA Mezclar con fingertiop vortex Incubar a 45 o 37 en baño de María Añadir loading buffer para detener la reacción.

Instrucciones de Reacciones Rotular 4 tubos (del 1-4) para cuatro reacciones de enzimas de restricción Golpear los tubos contra el bench para recoger el contenido en el fondo Servir 30µl de buffer de Rxn en cada tubo Añadir DNA, agua y enzima a los tubos de reacción según resumido en la tabla. Tapar el tubo y mezclar cuidadosamente. Vigile la fase del glicerol que no se acumule Spin para bajar todo el contenido al fondo Incubar 15 o 60 min a 45 o 37 grados respectivamente Añador X ul de loading buffer a los tubos de reaccion, mezle y esta lista para servir.

Reacciones

Incubación

Instrucciones de Gel Preparar gel al 0.8% de 6 carriles con pozos de 40µls. Pueden ser 2 geles de 15 carriles Servir 1 marcador 2 Plasmido sin cortar 3.Corte con HindIII 4.Corte con Bgl 5 Corte con HindIII y Bgl I

Grafica: Determinación de Tamaño de los fragmentos -Medir y registrar distancia migrada por cada banda del marcador (excpto el de 23,130, que no caerá en la linea) Mida y anote en cm Rotule papel semilog con Distancia en X en cm Rotula Log base pair en Y. Escoja la escala de manera que los puntos queden bien distribuidos Ciclos de 100 – 1000, de 1000-10000 Ubique cada punto en la grafica con Distancia y su tamano en Y Dibuja la mejor linea que pase por todos los puntos (Igual numero a cada lado de la linea) Mida la distancia de cada banda desconocida Extrapola en la linea recta los valores de los desconocidos

Usar este papel para analizar la gel

Preparación del mapa Prepare un mapa circular del plasmido de 4340. Marque la posicion para cortes de HindIII de acuerdo a los tamanos de la gel Dibuje un segundo circulo de 4340. Marque la posicion del corte para BglI en la parte superior lo que serian las 12. Para dibujar el mapa compuesto coloque uno de los circulos sobre el otro. Mantenga el de BglI a las 12 y rote el otro dibujo hasta que la distanca relativa entre los sitios de restriccion aproximen los tamanos relativos a los fragmentos de la digestion Compare los tamanos de los fragmentos de las digestiones simples con los de las dobles.