Enzimas Determinación de su actividad catalítica en distintos materiales biológicos

¿Qué son ? La mayoría son proteínas ( existe ARN catalítico ). ¿ que función cumplen? Catalizadores biológicos Sus propiedades son…. -elevada especificidad. -aceleran más rápido las reacciones químicas. -no se modifica en la catálisis. -están sujetas a controles celulares, genéticos y alostèricos. -son termolábiles y sensibles a cambios de pH.

Modelos de acción Modelo llave y cerradura: rigidez. Modelo de ajuste inducido: flexibilidad.

TRABAJO PRÁCTICO  OBJETIVO Identificar las enzimas mediante su actividad, frente a sustratos específicos

Tubo 1Tubo 2Tubo 3 Leche entera10 ml Pancreatina1 ml1 ml (hervida) 1 ml Rojo Fenol10 gotas Incubación 37°Csi no Preparar 3 tubos de ensayo:

Sacarasa: enzima hidrolasa cataliza hidrólisis de sacarosa

Extracción de sacarasa a partir de levadura

Preparar 3 tubos de ensayo: Tubo 1Tubo 2Tubo 3 Agua destilada1 ml --- Sol. Enzima1 ml---1 ml Sacarosa 1%---1 ml Incubación 37°C30 minutos

con sacarasa sacarasa

Amilasa salival : Hidrolasa segregada por las glándulas salivales Tubo 1Tubo 2Tubo 3Tubo 4 Saliva 1:91 ml Almidón 1%5 ml Temperatura0°C37°C0°C37°C Tiempo10 min. ReacciónLugol Fehling

Amilasa pancreática: Hidrolasa liberada por el páncreas Tubo 1Tubo 2Tubo 3Tubo 4 Pancreatina 2%1,5 ml---1,5 ml--- Almidón 1%1,5 ml Temperatura37°C Tiempo10 min. ReacciónLugol Fehling

Transaminasas B6 GOT GPT GPT: glutámico pirúvico transaminasa, alanin amino transferasa o ALAT GOT: glutámico oxalacético transaminasa, aspartato amino transferasa o ASAT

Transaminasas GOT GPT Sustrato ml0,5 Homog. Hervido----0,5----0,5 Homog. Sin herv0,5--0,5-- Incubar 30´ 37°C 2,4 DNFH ml0,5 Incubar 10´ 37°C NaOH 0,4 M ml5555

Cinética enzimática

El estudio de una enzima en un medio biológico involucra 2 análisis: 1- detección de la enzima: estudio cualitativo. 2- concentración de la enzima: estudio cuantitativo.  Para la detección de la enzima se evalúa la reacción química que cataliza específicamente, observando la desaparición de los reactivos o la aparición de los productos.  La cinética química estudia la velocidad de transformación de los reactivos en productos.

 La velocidad se expresa en términos del cambio en la concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo  A + B C + D  V= - dA o dC = K.[A].[B] dt dt La velocidad de reacción depende de: pH Temperatura Concentración de reactantes. Presión Presencia de catalizadores: enzimas

 Unidades de Actividad enzimática : Actividad que transforma 1 umol de sustrato por minuto a temperatura y presión dados.  Katal: Transformación de 1 mol de sustrato/ seg

E + S ES E + P V max [S] K m + [S] v = Ecuación de Michaelis Menten La forma característica de la curva de saturación de la enzima por el sustrato se expresa matemáticamente por la ecuación: k -1 + k 2 k1k1 KmKm = k1k1 k -1 k2k2 K m concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de su velocidad máxima

 En las reacciones enzimáticas en que participan más de un sustrato, cada uno de ellos posee su propia Km  La Km representa una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato.  Cuanto mayor es el valor de Km menor será la afinidad de la enzima por el sustrato.

V max [S] K m + [S] v0v0 = V max [S] K m + [S] v0v0 = 1 Ecuación de Lineweaver-Burk V max KmKm v0v0 = 1 + [S] 11 V max [S] KmKm v0v0 = 1 + [S] La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk y se utiliza para el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx.

El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centro activo de la enzima Similitud estructural con el sustrato Al aumentar la concentración de sustrato se desplaza al inhibidor Inhibición competitiva

La velocidad máxima permanece constante El valor de Km aumenta

El inhibidor se une en un sitio diferente al sitio activo de la enzima de manera que se puede unir a la enzima o al complejo ES pero en ninguno de los casos obtendremos productos. No se revierte por agregado de más sustrato Inhibición no competitiva

Objetivos del Trabajo Práctico:  Seleccionar las condiciones para estudiar la cinética de una reacción enzimática.  Determinar Km y Vmax de la reacción de hidrólisis enzimática de la sacarosa.

 La sacarasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa.  Velocidad = se expresa como concentración de sustrato hidrolizado por minuto.  Para conocer la concentración de sacarosa hidrolizada mediremos la concentración de glucosa liberada.

0,1 g de levadura + 25 ml de sol. EDTA 1% Centrifugar homogenato 5 min. a rpm Sobrenadante: extracto enzimático

TuboEnzima (ml) AcNa (ml) EDTA (ml) SACAROSA ml 0,2 M 0,15 M 0,1 M 0,05 M 0,025 M 0,01 M Blanco , ,5 1, ,5 1, ,5 1, ,5 1, ,5 1, ,5 1, AcNa: buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4,7 Dejar los tubos 10 minutos a 25 °C.

Blancotestigo Glucosa 1g/l ul --- Reactivo trabajo 2 ml Incubar en baño a 37°C por 15 minutos Leer a 505 nm llevando a 0 con el blanco Calcular concentración de glucosa en cada tubo comparando con el testigo. A los tubos del experimento anterior y luego de la incubación:

 Fundamento del método GOD Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2 POD 2 H2O2 + fenol + 4 AF quinoneimina + 4H2O Quinoneimina es un cromógeno rojo cereza con un pico máximo de absorción a 505 nm. El reactivo de trabajo es una mezcla de las enzimas GOD y POD, 4- aminofenazona y fenol en buffer fosfato pH 7.

Calcular la concentración de glucosa en cada tubo en g/l y en M. Calcular g de glucosa en 3 ml que tiene cada tubo. Calcular moles de glucosa Calcular moles de glucosa / minuto mol / min Glucosa velocidad moles sacarosa [S] CALCULAR GRAFICAMENTE Km y V max