Organización de la clase Proteínas II Organización de la clase Peso Molecular de una proteína. Métodos para determinarlo Tamiz Molecular Electroforesis en condiciones nativas y desnaturalizantes Ejercicios

Cada aminoácido tiene un determinado Peso Molecular (PM) Cada aminoácido tiene un determinado Peso Molecular (PM). Promedio = 128 Da Pero….. En un polipéptido de n aminoácidos hay n-1 enlaces peptídicos. En cada enlace peptídico se pierde 1 molécula de H20. En total se perdieron n-1 moléculas de agua Cuando el valor de n es alto, n-1 es casi = n Por lo tanto es válido calcular PM = n x 128 – n x 18 = n (128 – 18) = n x 110 es decir usar 110 Da como PM promedio de 1 aa en contexto polipeptídico Ejercicio de ejemplo: ¿Cuánto pesa un polipéptido de 100 aminoácidos?

Péptidos circulares Péptidos circulares

Cómo se determina el PM en el laboratorio Cómo se determina el PM en el laboratorio? Por ejemplo: mediante columnas del tipo “Tamiz Molecular”

otro esquema secuencial mostrando la salida (elución) de las moléculas

Analizando el comportamiento en Sephadex de proteinas de PM conocido, uno puede determinar el PM desconocido de una proteína de interés

Electroforesis en GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Soporte: Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración  variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro Electroforesis vertical 1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie

Las proteínas migran (“corren”) hacia el polo de carga eléctrica opuesta a la de su carga neta a una velocidad que depende de su tamaño, forma y relación carga/masa En condiciones “nativas”: las proteínas migran tal como existen en la célula (conformación nativa) con sus subunidades asociadas. Se siembra en el medio del gel porque uno no sabe de antemano qué carga neta tienen En condiciones desnaturalizantes (por efecto de urea y/o SDS): las proteínas migran desplegadas. Si tienen estructura 4ia, con sus subunidades separadas y desplegadas

la urea forma puentes H

La urea desnaturaliza proteínas porque forma puentes H con átomos O y N de las proteínas, rompiendo puentes H entre aminoácidos de la misma proteína

otro agente desnaturalizante: el Dodecilsulfato de sodio (SDS)

importante: el SDS hace que las proteínas expongan solamente cargas negativas (enmascara las positivas) y que igualen su relación carga/masa

Cuánto más largo es un polipéptido, más moléculas de SDS unirá, más cargas negativas tendrá. La relación m/q será igual para todas las proteínas, independientemente del tamaño

La PAGE con SDS es muy útil porque, al igualar la relación m/q, las polipéptidos desplegados corren de acuerdo a únicamente su tamaño (PM); sirve para determinar PM

SDS-PAGE: determinación del peso molecular de polipéptidos (o subunidades separadas) Marcadores de peso molecular: Mezcla de diferentes proteínas de las que conocemos el peso molecular. Extrapolando podemos calcular el PM de nuestra proteína.

Ejemplo real de resultado de PAGE/SDS distintas proteínas y cantidades de ellas

a pensar y discutir en clase para proteínas con estructura cuaternaria, PAGE/SDS puede servir para medir el PM del oligómero? (es una alternativa al uso de tamiz molecular) respuesta: a pensar y discutir en clase ayuda: hay que hacer un truco (pre-tratamiento químico) antes de PAGE/SDS

Ejercicios sabiendo la estructura cuaternaria, predecir el resultado de PAGE/SDS con y sin MSH: 1 subunidad de 50 kDa (monómero sin estructura 4ria) Homodímero de 2 subunidades iguales de 50 kDa unidas por uniones no covalentes Heterodímero formado por 1 subunidad de 50 kDa y otra subunidad diferente de 50 kDa unidas por uniones no covalentes y puentes S-S Heterodímero formado por 1 subunidad de 100 kDa y otra subunidad de 50 kDa unidas por uniones no covalentes y puentes S-S Heterotetrámero formado por 2 subunidades de 100 kDa y 2 subunidades de 50 kDa unidas por uniones no covalentes

2) Observando el resultado de PAGE/SDS, deducir la estructura cuaternaria Si el PM nativo es 100 kDa y se observa: 1 sola banda que migra a igual velocidad que la banda correspondiente a la de un marcador de 100 kDa 1 sola banda que migra igual que la de un marcador de 50 kDa 2 bandas: una que migra igual que un marcador de 70 y otra igual que un marcador de 30 kDa, con o sin MSH 2 bandas: una que migra igual que un marcador de 70 y otra igual que un marcador de 30 kDa solamente con MSH 1 sola banda que migra como marcador de 25 kDa con o sin MSH