CRECIMIENTO MICROBIANO  El crecimiento se define como un incremento en el número de células  En procariotas continúa hasta que se divide en dos nuevas células en un proceso llamado fisión binaria  Cada célula hija recibe un cromosoma completo y copias suficientes de macromoléculas, monómeros e iones inorgánicos para vivir en forma independiente  Bajo condiciones nutricionales estables la bacteria E. coli puede completar su ciclo en 20 minutos  El tiempo es variable y depende de factores nutricionales y genéticos

CRECIMIENTO POBLACIONAL  La velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de células por unidad de tiempo  El tiempo de generación es el requerido para duplicar una población de células  Este modelo en el que el número se duplica por unidad de tiempo se denomina crecimiento exponencial  Una característica es que al comienzo es bajo y luego incrementa en una explosión del numero de células  Se utiliza para ensayar el efecto positivo o negativo de algún tratamiento sobre el cultivo bacteriano

TIEMPO DE GENERACION  En un cultivo creciendo exponencialmente hay una relación directa entre el numero de células presentes en el momento inicial (N 0 ) y en un momento determinado del crecimiento N = N 0 * 2 n donde N= número final de células y n= número de generaciones  El tiempo de generación “g” de la población celular se calcula como: g = t/n donde t= horas o minutos  Los tiempos de generación son usados para ensayar efectos positivos o efectos negativos

CICLO PROCARIOTICO  Antiguamente se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos calve dado que no hay mitosis y la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo  En la actualidad se conocen fenómenos clave : fase C o de síntesis del ADN (equivalente a la S eucariótica); replicación del ADN; fase D que termina con el final de la división celular (equivale a la M eucariótica) ; fase de intervalo (similar a la G1 eucariótica)  Las fases C y D son relativamente constantes y cuando disminuye el tiempo de generación (g) lo hace a expensas de la fase G1. En el caso de E. coli la fase C= 40 minutos y la fase D= 20 minutos  Cuanto más rico es un medio, el tiempo de generación es menor y mayor es el tamaño medio de las células  Si se inocula una célula cultivada en un medio pobre (g=60 min, C+D= g) a un medio más rico (g=35 min) se observa: la primera división ocurre a los 60min idéntico al medio anterior, pero el inicio de una nueva ronda de replicación ocurre antes (C+D se superponen) y se obtiene un tamaño mayor que en el medio pobre y una masa de inicio mayor

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS  Una población bacteriana presenta un patrón de crecimiento cuando se inocula en un medio de cultivo fresco cerrado (líquido o sólido)  En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento dura sólo unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes y/o acumulación de desechos  En estos sistemas hay una fase de latencia (fase lag) de retraso mientras las células se ajustan a las nuevas condiciones es un período de ajuste metabólico que depende del tamaño del inóculo, bondad del inóculo (estado metabólico previo)  Fase exponencial o fase logarítmica de crecimiento continuo donde se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (menos de 10), el valor de (g) dependerá de la composición del medio, temperatura, pH, osmolaridad

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS  Fase estacionaria se caracteriza porque el coeficiente de crecimiento se hace nulo pero aun existe crecimiento que se equilibra con las muertes celulares, se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH se hace inadecuado, aun hay reacciones metabólicas pero el metabolismo es diferente (células son más chicas) al de la fase logarítmica, el citoplasma se condensa, la membrana se hace menos fluida y suele ser más resistente a los agentes físicos y químicos  Fase de muerte si la incubación continua en la fase estacionaria, las células empiezan a morir y hay incluso lisis celular, es también una función exponencial pero más lenta que la exponencial

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS SÓLIDOS  Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia.  Los tipos de gelificantes más usados para los medios sólidos: agar-agar (o simplemente, agar) es el más usado; gelatina (tiene el inconveniente que se licua a temperaturas relativamente bajas)  Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en placas de Petri.Tras la incubación a la temperatura y condiciones adecuadas, cada bacteria o agrupación bacteriana da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a simple vista, denominada colonia  La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10 7 células para una colonia de unos 5 mm). Se debe a que las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de nutrientes y eliminación continua de productos de desecho. Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.  Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias: tamaño, forma general y de bordes, color, consistencia, aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato

MEDICION DEL CRECIMIENTO CAMARA DE PETROFF HAUSSER  Se puede medir siguiendo los cambios en el número de células o el peso de la biomasa celular  El número de células se puede medir al microscopio y se llama recuento directo Se puede realizar en muestras secas o líquidas para las que se usan cámaras especiales de recuento donde el valor de células es convertido a células por mililitro de suspensión  Càmara de Petroff Hausser: portaobjeto especial con graduación en superficie y medidas concretas:  0.02 mm de profundidad  área de 1 mm 2 dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes  cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4 x 4= 16 cuadrados pequeños  la muestra se distribuye en 16 x 25= 400 celdillas

MEDICION DEL CRECIMIENTO  La muestra dispensada entre porta y cubre se deja reposar unos minutos y se cuenta el número de células en varias celdillas (en general 16 equivalente a un cuadrado grande), se anota el número n y se establece: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células / ml  Limitaciones: las células vivas no se distinguen de las muertas las células pequeñas son difíciles de apreciar se requiere habilidad para obtener precisión se necesita contraste de fases cuando la muestra no está teñida no es bueno para suspensiones poco densas, sólo sirve para suspensiones concentradas ( mayores a 10 x 10 6 cel./ml)

RECUENTO DE VIABLES  El recuento en placa determina el número de células capaz de generar colonias sobre la superficie de un medio sólido  Hay dos formas, por siembra en superficie: se siembra 0.1 ml de muestra y se extiende por la superficie con una barra de vidrio o metal  O bien, por siembra en profundidad: se siembra de 0.1 a 1.0 ml en la placa de Petri y se agrega el medio sólido fundido (40 ° C) y se incuba  Por este método se pueden usar volúmenes más grandes  Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista temperaturas de 40 a 45° C  El número de colonias que puede ser contado oscila entre colonias

DILUCIONES  Cuando el cultivo es denso se usa el método de diluciones  Se usan diluciones seriadas en base 10: 1.0ml de muestra en 9.0ml de diluyente o bien, 0.5ml muestra en 4.5ml de diluyente  El número de colonias depende del inóculo, medio de cultivo y las condiciones de incubación (medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación)  La expresión del resultado será como unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml) ya que la ufc puede contener más de una célula

MASA CELULAR Y TURBIDEZ  Medida de la masa bacteriana: Métodos directos  Se puede determinar el peso seco donde la masa seca (estufa a 105 º C toda la noche) es aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa húmeda  Inconvenientes: método tedioso que requiere tiempo y errores en pesadas ( 1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias)  o bien, el peso húmedo donde se centrifuga y se elimina el sobrenadante y se determina el peso del sedimento  Inconvenientes: grandes errores debido al líquido intercelular retenido, tipo y forma de las agrupaciones de la cepa, etc  Determinación de componentes característicos: peptidoglicano, ARN, ADN, proteínas se usan en bacterias que forman grumos no dispersables o crecen en filamentos en general se emplean en determinaciones en ambientes naturales  Métodos indirectos :  Turbidimètricos (ópticos): la base común consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o trasmitida a través del cultivo bacteriana. La dispersión de la luz dentro de ciertos limites es proporcional a la masa del cultivo

MASA CELULAR Y TURBIDEZ  Escala de Mc Farland: es una serie de patrones de turbidez (precipitado de SO 4 Ba) previamente calibrados y se establece la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o concentración de bacterias (células/ml) que genera una turbidez similar  Un método más útil es la medida de turbidez con fotómetro o espectrofotómetro que hacen pasar luz a través de las suspensión celular y detectan la cantidad de luz no dispersada  Los resultados se expresan en unidades fotométricas o unidades de densidad óptica proporcionales al número de células y a la masa celular

MASA CELULAR Y TURBIDEZ  Hay que realizar una curva estándar de calibración que relacione medidas directas (recuento en placa o microscopía) con las indirectas de turbidez  En el método de turbidimetría es necesario determinar el contenido de ufc/ml de la muestra original (de la cual se hicieron las diluciones para la calibración) con el método de recuento en placa.  Con esta información y las absorbancias de las diluciones, se hace una curva de calibración. Teniendo esta curva, se podrá determinar las ufc/ml de otras muestras luego de leer la absorbancia de las mismas.

 Contadores electrónicos de partículas : se pasa una suspensión bacteriana por un tubo capilar entre los dos polos de una corriente eléctrica  Cada vez que pasa una bacteria se interrumpe la corriente y es recogida por un dispositivo electrónico que detecta el numero y tamaño de las partículas que van pasando (el tamaño es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula)  Citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS): las partículas se marcan antes con anticuerpos monoclonales hacia alguna molécula de superficie y se unen a un fluorocromo (molécula que se excita al absorber la radiación láser y emite fluorescencia a diferente longitud de onda)

EL QUIMIOSTATO  Es un reactor que mantiene el crecimiento bacteriano en la fase exponencial  Es un cultivo continuo el volumen se mantiene constante (recambio entre medio fresco y usado) y se alcanza un estado de equilibrio entre el número de células y su estado metabólico  Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone: una cámara de cultivo de volumen constante a la que llegan nutrientes y de la que se eliminan los productos tóxicos de desecho  Características: estado constante o estable; concentración bacteriana y concentración del sustrato: constante; tasa de dilución y rendimiento celular: constante

 Se usan dos elementos de control: la velocidad de dilución y la concentración del nutriente limitante (C o N)  La velocidad de dilución controla la velocidad de crecimiento en rangos muy amplios y la densidad celular (células/ml) esta controlada por el nivel del nutriente limitante  Los parámetros a tener en cuenta son: f (ml/h); volumen cámara de cultivo (ml); densidad celular (x); factor de dilución D=f/v (h -1 )  Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt=0 y por tanto la cc de las células se hace constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado dinámico de equilibrio EL QUIMIOSTATO

 Los MO pueden cultivarse en una amplia gama de tasas de crecimiento exponencial y permite crecimientos balanceados y restringidos ya que el nutriente o sustrato está presente en una concentración baja como para limitar la densidad de población  Sin embargo, a tasas altas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente y el cultivo puede ser lavado totalmente (dilución crítica)  A muy bajas diluciones el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía ya que sólo se usa para reacciones de mantenimiento celular y no para crecimiento (energía de mantenimiento) como ser potencial de membrana, trasporte activo o síntesis de proteínas EL QUIMIOSTATO

 Aplicaciones:  Procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc)  Permite estudiar: aspectos fisiológicos (catabolismo de sustrato limitante), selección de mutantes ; estudios ecológicos  Su aplicación más conocida es para la depuración de aguas ya sea mediante procesos aeróbicos o anaeróbicos. El “medio de cultivo fresco” es el agua residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se retiran por decantación EL QUIMIOSTATO

FACTORES AMBIENTALES  El abanico es amplio y va desde puntos por debajo de la congelación del agua hasta 110° C, el rango habitual es 30° C  Se distinguen cuatro grupos:  Psicrófilos con temperaturas bajas 0-20 º C,  Mesófilas con medianas º C,  Termófilas más altas ° C  Hipertermófilas con muy altas º C  Congelación: existe un límite por el cual es imposible la reproducción, hay crioprotectores (glicerol y dimetilsulfóxido) que permiten su conservación a temperaturas (-70 ° C)  Termofilia: termófilos poseen membranas ricas en ácidos grasos saturados que les dan estabilidad a altas temperaturas. Las eucariotas están ausentes por encima de 60 ° C debido a la porosidad de sus membranas  La temperatura favorece reacciones del metabolismo bacteriano: -Acelera su capacidad de síntesis -Velocidad de multiplicación más rápida Regla de Van´t Hoff: "la velocidad de las reacciones químicas se duplica por cada incremento de 10º C de la temperatura

FACTORES AMBIENTALES

Cloruro de Sodio  Cloruro de sodio: el agua de mar tiene una concentración del 3%, los organismos que se aíslan del mar tienen requerimientos específicos para el sodio y se llaman halófilos pudiendo ser:  Moderadamente halófilo (6-15%),  Discretamente halófilo (1-6%),  Halófilos extremos (15-30%)

pH y ACTIVIDAD DEL AGUA  Acidez y alcalinidad - pH: sólo unas pocas especies pueden crecer a pH extremos, la mayoría de los ambientes naturales tiene 5.9. Según su tolerancia al pH:  Los que crecen a pH ácidos (1-5.5) son acidófilos  Los que crecen a pH básicos ( ) alcalófilos  Los que crecen a pH neutro ( ) neutròfilos  La mayoría de las bacterias tienen su pH óptimo (exterior) entre 5-9 y cambian el pH de su hábitat acidificando o alcalinizando y con ello facilitan o impiden la supervivencia de otras especies bacterianas.  Acidógenas: acidifican su entorno al liberar productos ácidos  Acidúricas: crecen en un medio ácido y son capaces de hacerlo más ácido  Actividad el agua: la disponibilidad el agua se expresa en términos físicos como actividad del agua (a w ) y sus valores oscilan entre 0 y 1  Osmosis: es el proceso por el que el agua difunde desde una región de alta cc (baja en soluto) a una región de baja cc (alta en soluto)  Plasmólisis: se produce cuando la célula está en ambiente con baja actividad del agua y existe una tendencia de salida del agua intracelular

NECESIDADES DE OXIGENO Bacterias aeróbicas estrictas: utiliza concentraciones del 20% más de Oxígeno Metabolismo : Alimento + O 2 → Material celular + CO 2 + H 2 O Microaerófilos: necesita concentraciones muy bajas de Oxígeno. 2-10%. Tienen superóxido dismutasa (SOD) y pueden o no tener catalasa Bacterias anaeróbicas estrictas: No tolera nada de Oxígeno. Les resulta tóxico y mueren, solo crecen si hay 0.5%. No tiene ni SOD ni catalasa El oxigeno es un tóxico, su metabolismo es: Bacterias anaeróbicas facultativas: utiliza oxígeno solo si lo hay. No tiene problema para sobrevivir pero si hay oxígeno crece más rápido, 2-8%, tienen SOD y catalasa Anaerobio aerotolerante: no necesita oxígeno para crecer y multiplicarse. Tolera el oxígeno pero no lo utiliza. Tienen SOD pero no catalasa

NECESIDADES DE OXIGENO  El Oxígeno es tóxico para algunos porque no tienen las enzimas SOD y catalasa, que degradan a los radicales libres del Oxígeno que son tóxicos. Con estas enzimas (SOD y Catalasa), las bacterias pueden vivir con oxígeno  El consumo de oxígeno es necesario para la respiración celular (para obtener ATP)  Toxicidad del Oxígeno: elementos tóxicos:  H 2 O 2 : Peróxido de Hidrógeno  O2 - : radical superóxido  OH - : radical hidroxilo  Enzimas que intervienen:  Superóxido dismutasa: 2 O H H 2 O +O 2  Catalasa o peroxidasa: H 2 O H 2 O + O 2