Inducción de proteína recombinante b-Lactamasa

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

cDNA

Inducción de proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80% ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales .... depende de la complejidad de la proteína

Sistemas biológicos de producción de PR Bacterias E. coli B. subtilis Células eucariontes Hongos Levaduras Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris y otros metilotróficos Hongos filamentosos Células animales en cultivo Células de insecto en cultivo Plantas Maximizar la expresión de proteínas codificadas por genes clonados

Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Selección de vectores Vector híbrido o recombinante

¿Qué huésped? ¿Qué DNA? Organismo, tejido, fracción sub-celular ¿Qué vector? pGEM pGEX Gatawey pET ¿Qué DNA? Organismo, tejido, fracción sub-celular Análisis in silico de secuencia, ER ¿Qué huésped?

Vector de clonación pET-24a(+)

Selección de bacterias transformadas

Vector de recombinación pET- TEM-1 7200 bp

Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características: Cromosoma de Escherichia coli

Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

Análogos de la lactosa

Procedimiento de proteína recombinante Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD600 0.6-0.8 Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la construcción: En el vector pET-TEM se insertaron los genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

Purificación de la proteína recombinante

Proteina GFP

Purificación de la proteína recombinante

RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO…. 2h 1.5 h 1h 0 Después de la inducción