Inducción de proteína recombinante

Presentación del tema: "Inducción de proteína recombinante"— Transcripción de la presentación:

1 Inducción de proteína recombinante
b-Lactamasa

2 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

3 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

4 cDNA

5 Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80% ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-raduccionales .... depende de la complejidad de la proteína

6 Sistemas biológicos de producción de PR
Bacterias E. coli B. subtilis Células eucariontes Hongos Levaduras Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris y otros metilotróficos Hongos filamentosos Células animales en cultivo Células de insecto en cultivo Plantas Maximizar la expresión de proteínas codificadas por genes clonados

7 Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Selección de vectores Vector híbrido o recombinante

8 Vector de clonación pET-24a(+)

9 Selección de bacterias transformadas

10 Vector de recombinación pET- TEM-1
7200 bp

11 Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

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13 El sistema de expresión también debe tener las siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli

14 Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

15 Análogos de la lactosa

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18 Procedimiento de proteína recombinante
Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

19 Peculiaridades de la construcción:
En el vector pET-TEM se insertaron los genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

20 Purificación de la proteína recombinante

21 Proteina GFP

22 Purificación de la proteína recombinante

23 RESULTADOS DEL SEMESTRE PASADO
2h h h Después de la inducción