Expresión en células de mamífero Transfección

Presentación del tema: "Expresión en células de mamífero Transfección"— Transcripción de la presentación:

1 Expresión en células de mamífero Transfección
Plásmidos: Transbordador (shuttle). Los pasos de clonado en bacterias (Ori, resistencia antibióticos, sitios múltiple clonado, etc.). Estable/transiente. Origen de replicación de virus (SV40, EBV) y la línea celular a la que se le ha incorporado el gen de la proteína necesaria para usar este origen (T large, EBNA-1). Promotores y señal de poliadenilación que funcionen en estas células. Promotores fuertes de virus (pCMV, pSV40), regulables (on y off, dosis dependiente). PoliA de BGH, SV40.

2 Expresión en células de mamífero Transfección
Plásmidos: Marcador de selección Resistencias: (G418 (Neomicina fosfotransferasa; μg/mL; 2 semanas); Hygromicina B (Hygromicina fosfotransferasa; 75 μg-1,2 mg/mL); Blasticidina (gen bsd; 2-10 μg/mL); Zeocina (gen Sh ble; 50 μg- 2 mg/mL) Suplementación del medio para cepas deficientes en alguna vía metabólica. .

3 Xantina-guanina fosforibosil transferasa
Timidina quinasa Xantina-guanina fosforibosil transferasa Dihidrofolato reductasa

4 Expresión en células de mamífero Transfección
Gen reportero: t-PA: tissue plasminogen activator (se secreta, forma zonas trasparentes en un gel de fibrina y plasminógeno). Sensible, no cuantifica, sólo identifica. GFP: green fluorescent protein (microscopio y FACS). Fusión N- o C- terminal. Dirigidos a distintas localizaciones sub-celulares. CAT: Chloramphenicol acetyltransferase (ensayo de actividad). No hay actividad en células eucariotas, no es tóxico para ellas. Ensayo de alta sensibilidad y reproducibilidad. β-gal: β-galactosidase. MUG (fluorómetro), ONPG (espectrofotómetro), X-gal (histoquímica), FDG (FACS). Firefly luciferase: oxida luciferina (ATP, Mg2+) liberando un fotón.

5 Expresión en E. Coli Expresión desde un vector estándar en un número de distintas cepas de la bacteria. La elección de la cepa depende de la naturaleza heteróloga de la proteína: Si contiene muchos codones raros (cepas que co-expresan tRNAs para ellos):

6 Expresión en E. Coli Si contiene uno o más puentes disulfuro (mejor plegamiento en cepas con ambiente citosólico más oxidante, de NOVAGEN): Si es tóxica para la célula usar cepas que contengan pLysS o pLysE (control estricto del promotor T7, Lisozima inactiva la T7 RNA polimerasa). Varias en el comercio. Recuerden también probar distintos caldos de cultivo: a veces más simple que el LB (medios salinos, M9) o más ricos (Terrific Broth)

7 Expresión en E. Coli Hasta 50 mL 37ºC hasta DO600 = 0,4-1 Antibiótico
Buena agitación y aireación 1 colonia aislada Cosecha: centrifugación a 6000 g por 20 min. Conservar a -20ºC