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Proteína recombinante
β-Lactamasa
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Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
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Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
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cDNA
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Inducción a las proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones .... depende de la complejidad de la proteína
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Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones Vector híbrido o recombinante
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OPERON LAC
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Vector de clonación pET-24a(+)
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Selección de bacterias transformadas
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Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción
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El sistema de expresión también debe tener las siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli
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El vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene
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Análogos de la lactosa
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Diferencias entre DH5alfa y BL21(DE3)
DH5 alfa: tiene al gen recA mutado, por lo que no puede realizar recombinaci{on heteróloga (asugura la estabilidad del inserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo la digestión del plásmido. Esta cepa es competente para la seliección de colonias azules y blancas. BL21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos a las proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasa T7 (cepa DE3) que se induce con IPTG.
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Problemas…
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BL21
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Inducción
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Procedimiento Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL) Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 0.5 ó 1 mM (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante (!!!) Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar (10 min a 95 ͦ C). Correr en SDS-PAGE.
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Peculiaridades de la construcción:
En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis
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Purificación de la proteína recombinante
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RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….
2h h h Después de la inducción
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Proteina GFP
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Purificación de la proteína recombinante
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