Proteína recombinante β-Lactamasa
Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
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cDNA
Inducción a las proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones .... depende de la complejidad de la proteína
Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones Vector híbrido o recombinante
Vector de clonación pET-24a(+)
Selección de bacterias transformadas
Vector de recombinación pET- TEM-1 7200 bp
Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción
El sistema de expresión también debe tener las siguientes características: Cromosoma de Escherichia coli
Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene
Análogos de la lactosa
Procedimiento Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL) Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD600 0.6-0.8 Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar. Correr en SDS-PAGE.
Peculiaridades de la construcción: En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis
Purificación de la proteína recombinante
RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO…. 2h 1.5 h 1h 0 Después de la inducción
Proteina GFP
Purificación de la proteína recombinante