MICROBIOLOGIA GENERAL 1 TAXONOMIA MICROBIANA Clasificación e Identificación Metodologías Autoría: Ing. Dra. Silvia M. Raffellini

2 BIBLIOGRAFÍA Tortora G., Funke B., Case C. Introducción a la microbiología; Zaragoza : Acribia, ° Ed. Código de Biblioteca: 576.8/T714/ Cap. 9// 9° Ed. Bs. As. Ed. Médica Panamericana, 2007 (cap.10)// Ed. 12 – Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1994 (9 ed.) Código Biblioteca BER BER 9A 1994 Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1°Ed 1984(vol 1)- 1989(4 volúmenes) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001(vol 1) (vol 2) – 2009 (vol 3) – 2010 (vol 4) – 2012 (vol 5) Mac Faddin J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3°Ed. Ed. Médica Panamericana Madigan M., Martinko J., Parker J. Brock, Biología de los microorganismos, desde 8 a ed. (cap. 15 y 21); 12° Ed. Cap. 14 y 32. Código Biblioteca: 579 MAD BRO 8A 1998

3 TEMARIO Taxonomía y concepto de especie en procariotas Características empleadas en Taxonomía (clásica y polifásica) Filogenética: clasificación y relación evolutiva por ARNr 16S, árbol filogenético Diversidad bacteriana Identificación: métodos y problemática Identificación de cepas: género – especie – similitud entre cepas (Tipificación)

4 La taxonomía es la ciencia de la clasificación biológica Clasificación: ordenamiento de los seres vivos en grupos o taxones en función de semejanzas o parentesco evolutivo. Comprende tres áreas independientes pero relacionadas: Nomenclatura : asignación de nombres a los grupos taxonómicos de acuerdo con criterios y normas establecidos internacionalmente. Identificación: proceso mediante el cual se determina a que grupo taxonómico reconocido previamente establecido pertenece un organismo que se aísla. (“Aspecto práctico de la taxonomía  uso de esquemas de clasificación para determinar la identidad de un organismo aislado ”) TAXONOMÍA BACTERIANA Definiciones

5 Clasificación y nomenclatura –Caracterización exhaustiva: datos fenotípicos, genotípicos (“taxonomía clásica”) y filogenéticos (“taxonomía polifásica”) –Aplicación de teoría y método de clasificación –Formación de grupos taxonómicos (taxones) –Nomenclatura Identificación –Caracterización del organismo aislado usando número limitado de tests adecuados al problema –Comparación con spp. conocidas –Asignación a una sp. –No identificado: estudio taxonómico Definiciones

6 ♦ Al preparar un sistema de clasificación, se ubican todos los microorganismos en grupos homogéneos, que a su vez pertenecen a otro grupo más amplio siguiendo una estructura jerárquica sin superposiciones horizontales. ♦ Una categoría de cualquier rango une grupos de nivel inferior en función de propiedades comunes  categoría + alta: >N° de unidades taxonómicas <N° de propiedades compartidas ♦ En la taxonomía bacteriana los niveles o rangos utilizados son los siguientes (en orden ascendente): ● ESPECIE (species) ● GÉNERO (genus) ● FAMILIA (family) ● ORDEN (order) ● CLASE (class) ● FILO (phylum) ● (REINO) NO ASIGNADO PARA BACTERIAS ni ARCHAEA ● DOMINIO (domain) (Bacteria – Archaea – Eukarya) El grupo taxonómico básico es la ESPECIE Definiciones CLASIFICACIÓN

7 Definición de especie ESPECIE es un grupo de poblaciones naturales que se reproducen entre si y que están aisladas de otros grupos desde el punto de vista de la reproducción. ESPECIE BACTERIANA es una colección de cepas que comparten numerosas propiedades estables y que difieren de forma significativa de otros grupos de cepas. Una CEPA es una población de microorganismos que desciende de un único organismo o de un aislamiento en cultivo puro. Cada especie se asigna a un GÉNERO, el siguiente rango de la jerarquía taxonómica. Un GÉNERO es un grupo bien definido de una o más especies que está claramente separado de otros géneros. Para los taxónomos que trabajan con organismos superiores Para los microbiólogos Definiciones

8 NOMENCLATURA ☻Los microbiólogos asignan nombre a los microorganismos de acuerdo con el SISTEMA BINOMIAL del botánico sueco C. Linnaeus (1735). ☻ El nombre latinizado y en cursiva consta de dos partes: El primer nombre, escrito con mayúscula, es el nombre genérico. El segundo nombre, en minúscula, es el epíteto de la especie. Escherichia coli ☻ A menudo se abrevia el nombre genérico con una letra mayúscula E. coli Definiciones

9 Dominio Reino Filo Clase Orden Familia Género Especie Proteobacterias Enterobacteriales Enterobacteriaceae E. coli Rosa Levadura de cerveza Perro Definiciones

10 ESTRUCTURACIÓN JERÁRQUICA EN TAXONOMÍA Definiciones

11 SUBESPECIE Basada en variaciones fenotípicas y genotípicas menores, pero constantes. Es la categoría más baja aceptada oficialmente en la nomenclatura Nombre trinominal Lactobacillus casei subsp. rhamnosus Lactobacillus casei subsp. casei Definiciones

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13 serovariedad o serotipo (antígenos distintos) fagovariedad (tipificación por fagos) biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) patovariedad (patogenicidad) morfovariedad (diferencias morfológicas) genomovariedad (grupos con ADN similares) Categorías de clasificacion a nivel de infrasubespecie (tipificación) Variedades o tipos Salmonella tiene alrededor de 2600 serotipos Salmonella enterica subsp. enterica serov Typhi Definiciones

14 Nivel taxonómicoBacteriaArchaeTotal Dominios112 Phyla23326 Clases32840 Órdenes Familias Géneros Especies Niveles taxonómicos y número de especies procariotas oficialmente reconocidos (2001) Fuente: Garrity G., Boone D., Castenholz R. (Eds.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2°Ed, Vol. 1. Springer, NY Definiciones

15 Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1974 (8 ed) 1994 (9ed) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1 a Ed 1984(vol 1)-1989(4 volúmenes) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 2 a Ed 2001(vol 1): Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria (vol 2): Proteobacteria (tres partes) 2009 (vol 3): Firmicutes (low mol% G+C Gram positive) 2010 (vol 4): Chlamydiae - Spirochaetes – Bacteroidetes 2012 (vol 5): Actinobacteria (high mol% G+C Gram positive) Características fenotípicas a tener en cuenta para identificar cepas (o sea “determinar a que especie pertenecen)

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17 PUBLICACIONES PERIÓDICAS International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología COLECCIONES (cepas tipo y otras: cultivos vivos, congelados) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana) CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia) Escherichia coli Type strain (Cepa tipo): E. coli ATCC Serotype: O1:K1(L1):H7 GenBank accesion number (16S rRNA): X80725

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19 Clasificación Ordenamiento de los organismos Sistemas de clasificación (criterios) Ubicación en taxones SemejanzasSemejanzas: Fenotípicas - Genotípicas Patrón evolutivoPatrón evolutivo: SISTEMATICA (FILOGENIA) Estudio de la historia evolutiva de los organismos Definiciones

20 Características empleadas en TAXONOMIA (clásica) : CLASIFICACIÓN - IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICAS Morfológicas: morfología celular y colonia (forma-tamaño-color), esporas ultraestructura, tinción, cilios y flagelos, movilidad, inclusiones Fisiológicas y metabólicas: fuentes de energía, C y N, componentes de la pared celular (tipo de peptidoglucano, ácidos teicoicos), productos de fermentación, tipo nutricional, pH, temperatura de crecimiento, luminiscencia, tolerancia osmótica, relaciones con el oxígeno, pigmentos fotosintéticos, necesidad y tolerancia a la sal, metabolitos secundarios, sensibilidad a antibióticos Ecológicas: Ciclo vital, Relaciones simbióticas, Patogenicidad Preferencia de hábitat (pH; oxígeno; aw) Serología – Fagotipia GENOTÍPICAS (ácidos nucleicos) - Composición % G + C - Hibridación de Ácidos Nucleicos (DNA-DNA; Tm; ARN/ADN)

21 Contenido G+C % G+C = G + C x 100 G + C + A + T determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía Amplio rango en procariotas: 20 al 80% Poca información para la caracterización taxonómica criterio de exclusión: ∆%GC > 3, probablemente especies diferentes ∆%GC > 10, probablemente géneros diferentes Características genotípicas clásicas Características

22 Longitud de onda (nm) ADN simple hebra ADN doble hebra Absorbancia Abs. relativa 260 nm temperatura (ºC) T m = 86ºC ADN doble hebra ADN simple hebra desnaturalización T m : punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN- ADN o de ADN- ARN Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion DESNATURALIZACION TÉRMICA Características

23 Hibridación ADN-ADN - depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN 1 - ADN 2 Δ T m del híbrido - es el criterio actual de definición de especie Definición metodológica estándar: -% de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN 1 -ADN 2 ) Características

24 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS -Aislar DNA de μo a comparar -Cortar DNA y marcar 1 - Desnaturalizar (Ø) -Mezclar DNA marcado con DNA μo a comparar (exceso) -Enfriar mezcla - Medir radiactividad en DNA bicatenario

25 ESTABILIDAD TÉRMICA DEL HÍBRIDO Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

26 Concepto en revisión continua ESPECIE BACTERIANA Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas y genómicas) Definición metodológica estándar : - % de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN 1 -ADN 2 )

27 TAXONOMÍA POLIFÁSICA  Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc) - marcadores quimiotaxonómicos - perfil de proteínas totales y enzimas - perfil de ácidos grasos  Filogenéticos: basados en secuenciación gen ARNr 16S  Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA nuevos: fingerprinting (perfiles moleculares por restricción) PCR (amplificación de ADN) Secuenciación de ácidos nucleicos Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres:

28 Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en la taxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).

29 Marcadores quimiotaxonómicos - Análisis químicos con equipamiento especializado -no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos -alto grado de discriminación -presentes en distintas estructuras celulares CARACTERES FENOTÍPICOS Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo en Planctomyces y Mycoplamas Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

30 Fingerprinting de ácidos nucleicos “Huella dactilar” - Enzimas de Restricción -Sondas marcadas - PCR CARACTERES GENOTIPÍCOS

31 PCR Reacción en cadena de la polimerasa (sigla en inglés: PCR = Polymerase Chain Reaction) Técnica de biología molecular (1986) cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificarlo, emplearlo para identificar microorganismos, manipularlo para su secuenciación, etc. ADN polimerasa primers o cebadores oligonucleótido complementario a zona adyacente a la región a amplificar ADN incógnita nucleótidos (A-T-G-C)

32 PCR para amplificación de secuencias específicas de DNA 94°C 40-65°C 72°C 94°C 40-65°C 72°C

33 Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies)  CLASIFICACIÓN Compara la secuencia de moléculas (que se comportan como “cronómetros evolutivos”) y establece la relación entre ellas  las secuencias son registro histórico de la evolución CARACTERES FILOGENÉTICOS PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO - distribución universal (presente en todos los organismos, con función homóloga) -secuencias que permitan identificar regiones homólogas y heterogéneas -La tasa de cambio de la secuencia de la macromolécula debe estar en correlación con la distancia evolutiva Molécula usada para determinar relaciones filogenéticas de organismos ARNr 16S (Carl Woese) Secuenciamiento directo – 1500 nucleótidos

34 Estructura secundaria del ARNr 16/18 S de los tres Dominios ☺ Los puntos rojos señalan posiciones en las que arqueas y bacterias suelen diferir Bacteria Archaea Eucarya Filogenia

35 Amplificación de genes de rRNA 16 S mediante PCR para posterior secuenciación Filogenia

36 Árboles filogéneticos Uso de programas para alinear secuencias (BLAST) y construir árboles filogenéticos Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva Similitud de secuencias implica similitud en los genes

37 Árbol filogenético de los principales linajes del Dominio Bacteria basado en la comparación de secuencias de ARNr 16S Filogenia

38 Cladogramas 1  2  3  Filogenia

39 Relación entre la definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en más del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70% especies diferentes Definición especie: % de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% Si diferían en más del 3% en RNA, % DNA-DNA < 70%

40 CRITERIOS PARA DIFERENCIACION DE ESPECIES Y GÉNEROS EN SISTEMA DE CLASIFICACION ACTUAL Criterio% G + CDNA/DNA∆ Tm16 r RNA = especie∆ < 3%> 70%∆ < 5°C∆ < 3% = género∆ < 10%> 20% < 5% distinto género

41 CLASIFICACION DEL DOMINIO BACTERIA Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 2°Ed (2001) categoriza a las bacterias en taxones basados en la secuencia de ARNr (ordenamiento jerárquico taxonómico) 23 Filos (Phylum) Caracterización completa de géneros -Morfología celular y de colonia, movilidad, coloración de Gram, estructura celular - Requerimientos ambientales (de oxígeno, etc.), nutricionales. Fisiología y metabolismo -Genética (% G+C), mutantes, plásmidos, fagos, bacteriocinas, antibióticos -Tratamiento filogenético, datos moleculares -Estructura antigénica, serotipificación – Patogenicidad - Ecología -Metodología de enriquecimiento, aislamiento, mantenimiento, ensayos especiales -Diferenciación de otros géneros - Comentarios taxonómicos – Listado descripción y difernciación de sp. y subsp.

42 Filo XII Proteobacteria (vol. 2) cinco clases Se divide en cinco clases, según los estudios de las secuencias de ARNr, que se denominan según las letras griegas de alpha a épsilon Alfa Proteobacteria: incluye géneros fotótrofos, géneros que metabolizan compuestos C1 (Methylobacterium), simbiontes de plantas, fijadores de N 2 (Rhizobium) y patógenos (Rickettsia, Brucella). Beta Proteobacteria: incluye géneros quimioheterótrofos pero también quimiolitótrofos (Nitrosomonas, oxidante de amonio), algunos fotótrofos y fijadores de N 2. Dentro de esta clase se incluyen patógenos como Neisseria (gonorrea y meningoencefalitis) y algunas especies de Burkholderia GRAM NEGATIVAS 20 Filos

43 Gamma Proteobacteria: incluye los diversos órdenes de bacterias de importancia médica y científica (Pseudomonadales -al que pertenece Azotobacter -, Legionellales, Vibrionales, Enterobacteriales, Pasteurellales). Este grupo incluye varios patógenos importantes, como por ejemplo, Salmonella (enteritis y fiebre tifoidea), Yersinia (peste), Vibrio (cólera), Pseudomonas aeruginosa (infecciones del pulmón en pacientes hospitalizados o con fibrosis quística). Delta Proteobacteria: incluye los géneros Myxococcus y Bdellovibrio, parásitos de otras bacterias, y el género Desulfovibrio Epsilon Proteobacteria: incluye los patógenos humanos Campylobacter y Helicobacter. La mayoría de las especies pertenecientes a esta clase habitan en el tracto digestivo de seres humanos y animales

44 Bacterias Gram negativas No-proteobacteria 1.El phylum Cyanobacteria corresponde a los fotoautótrofos que utilizan la luz como fuente de energía y CO 2 como fuente de carbono y producen O 2 durante la fotosíntesis (vol. 1) 2.Los quimioheterótrofos incluyen Chlamydia (phylum Planctomyces), Bacteroides (phylum Bacteroides), Fusobacterium (phylum Fusobacteria) y Treponema, Borrelia y Leptospira (phylum Spirochetes). Muchos de ellos patógenos humanos (vol. 4)

45 GRAM POSITIVAS El Manual Bergey divide a las bacterias Gram Positivas de acuerdo a su contenido de G+C (phylum Actinobacteria) 1.Bacterias Gram Positivas de alto contenido de G+C (phylum Actinobacteria) incluye el importante género Mycobacterium y los géneros filamentosos Actinomyces y Streptomyces. También incluye Corynebacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium y Micrococcus (vol. 5) phylum Firmicutes 2. Bacterias Gram Positivas de bajo contenido de G+C (phylum Firmicutes) incluye los órdenes Clostridiales (Clostridium), Bacillales (Bacillus) Lactobacillales (Staphylococcus, Streptococcus, Listeria y Lactobacillus). (vol. 3)

46 Identificación - Esquema de Identificación ≠ Esquema de clasificación (determinativo ≠ sistemático) - Los caracteres para la identificación deben ser pocos y fácilmente determinables (rápidos y baratos).Tinciones – Tests fisiológicos y bioquímicos (baterías de tests).Reacciones serológicas (aglutinación; anticuerpos fluorescentes; ligados a reacción de color) - Fagotipificación.Sondas genéticas (“DNA probes”) - Métodos Estandarizados: tamaño y tipo de inóculo, medios, temperaturas y tiempo de incubación, criterios para interpretar resultado de reacción -Empleo de cepas de referencia y controles + y -

47 DIFICULTADES EN LA IDENTIFICACIÓN PUROTrabajar con un cultivo PURO Trabajar desde categorías mayores a menores específicas (Gram – morfología celular – movilidad – tipo general de metabolismo – O 2 ) APLICAR EL SENTIDO COMÚN EN CADA PASO Usar el menor número de pruebas Comparar el aislamiento con cepas tipo o de referencia

48 DIFICULTADES EN LA IDENTIFICACIÓN CUANDO NO SE LOGRA IDENTIFICAR EL AISLAMIENTO: Controlar pureza Asegurarse que se han realizado las pruebas apropiadas Controlar que los métodos sean confiables Que se han usado correctamente las distintas claves y tablas

49 Identificación de género y especie Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 1994 (9ed) -Proporciona esquemas de identificación (listas de características que permiten ubicar el microorgansimo aislado en sistema de clasificación concebido con anterioridad – FINES PRÁCTICOS) -35 grupos de microorganismos Grupo 4: Bastones y cocos Gram negativos aerobios Grupo 5: Bastones Gram negativos anaerobios facultativos Grupo 17: Cocos Gram positivos Criterios Morfología – tinción – requerimientos de oxígeno – pruebas bioquímicas  PROCEDIMIENTOS HABITUALES DE LABORATORIO

50 Algunos grupos microbianos habituales en alimentos Eucariotas Hongos y Levaduras Deterioro - Micotoxinas Procariotas Bacterias Deterioro - Infecciones/Intoxicaciones Gram (-) Enterobacteriaceae Bastones No esporulados Anaerobios facultativos (AF) E. coli -Salmonella sp. Cronobacter sakazakii Erwinia sp. Pseudomonadaceae Bastones No esporulados Aerobios Pseudomonas sp. P. aeruginosa Otros Vibrio sp. Campylobacter sp. Gram (+) Esporulados (bastones) No esporulados (cocos o bastones) Aerobios o AF Bacillus sp. B. cereus Anaerobios Clostridium sp. C. botulinum C. perfringens Cocos S. aureus Enterococcus sp. Micrococcus sp. Streptococcus sp. Bastones Listeria sp. Lactobacillus sp. Letras azules: microorganismos que producen deterioro Letras rojas: microorganismos patógenos y/o indicadores AF: anaerobios facultativos

51 CLAVES DICOTOMICAS DE IDENTIFICACIÓN Mac Faddin

52 Identificación de bacteria entérica mediante técnicas microbiológicas clásicas utilizando exclusivamente criterios fenotípicos. La mayoría de los pasos a seguir requieren que el microorganismo crezca en cultivo puro. SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN TRADICIONAL

53 Cloruro de litio y telurito de potasio: inhibir desarrollo de flora microbiana acompañante -Piruvato de sodio y glicina: estimular selectivamente el crecimiento de estafilococos. -Yema de huevo: colonias convexas negros rodeadas de zona transparente debido a la lipólisis y proteólisis. MicroorganismosCrecimientoApariencia E. coliNinguno P. mirabilisBuenoMarrón S. aureus Bueno a excelente Negras con borde blanco, rodeado de una zona clara. S. epidermidisEscaso o bueno negra, tamaño irregular. Zona opaca alrededor de la colonia sin zona clara alrededor. E. faeciumEscaso Igual al anterior MicrococcusEscaso Colonias marrón a negro. AGAR BAIRD PARKER

54 AGAR ENDO

55 Clostridium perfringens (Gram positivas) Escherichia coli (Gram negativas)

56 a)Aerobios estrictos b)Anaerobios estrictos c)Anaerobios facultativos d)Microaerófilos e)Anaeobios aerotolerantes Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su tolerancia al O 2

57 negativapositiva Prueba de la catalasa catalasa H 2 O 2 + H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Catalasa (-) Anaerobios estrictos y an. aerotolerantes Catalasa (+) Aerobios, microaerófilos y an. facultativos

58 Prueba OF en 2 tubos: oxidativa Prueba OF en 2 tubos: Fermentativa Aerobios - MicroaerófilosAnaerobios Facultativos – An. Aerotolerantes Anaerobios Estrictos ¿?

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60 PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA EN Escherichia coli y Enterobacter aerogenes Productos finales Moles por 100 moles de glucosa E. coliE.aerogenes Butilenglicol CH 3 -CHOH-CHOH-CH 3 066,5 Etanol CH 3 -CH 2 OH4270 Á. succínico COOH-CH 2 -CH 2 -COOH280 Á. láctico CH 3 -CHOH-COOH843 Á. fórmico HCOOH218 Á. acético CH 3 -COOH440,5 Hidrógeno H Dióxido de carbono CO

61 Indicadores de pH

62 Pruebas Bioquímicas para Identificación de Bacterias PruebaPrincipioMétodo Utilización del citrato (“C”) Utilización de citrato como única fuente de C alcaliniza el medio Citrato + BTA Color azul indica pH alcalino Prueba de Indol (“I”) Conversión del AA triptofano en Indol Detección de Indol en el medio con dimetil- aminobenzaldehído (rojo) P. Rojo de Metilo (“M”) Producción de ácidos en fermentación disminuye el pH por debajo de 4,3 Crecimiento en caldo glucosa – Añadir indicador Rojo de Metilo (rojo) Prueba de Voges Proskauer (“VP”) Se produce acetoína a partir de fermentación de azúcares Detección de acetoína en el medio utilizando  -naftol

63 Reacciones de IMViC E.coli E. aerogenes I : + - M: + - VP: - + C : - + (“I”)(“I”) (“C”)(“C”) (“M”)(“M”) (“VP”)VP

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65 Identificación de cepas específicas de una especie dada TIPIFICACIÓN M. tradicionalesM. tradicionales -Serotipificación: aglutinación, ELISA (directa: bact?+ac; indirecta: bact + ac?) center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html#3 center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html#3 – Western blot (bact + ac?) -Fagotipificación

66 Identificación de cepas específicas de una especie dada TIPIFICACIÓN  M. basados en DNA fingerprinting -DNA fingerprinting + AGE + sonda (RFLP) -DNA fingerprinting usando PFGE (sin sonda-BE) -Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) strain typing (primers de 10 bp – separación por electroforesis en gel de agarosa) -

67 Detección de enterotoxinas de S. aureus TEST ELISA (“Enzyme linked immunoabsorbent assay”) Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas Etapa I: Adición de la muestra Etapa II: Formación de “sandwich” Etapa III: Visualización de punto final (color) -P. de microtitulación + anticuerpos específicos S. aureus - Muestra (antígeno) - Anticuerpo específico S. aureus conjugado con enzima - Complejo “sandwich” -Sustrato químico + complejo enzima- anticuerpo-antígeno - COLOR Fuente imágenes: TECRA ®

68 DNA FINGERPRINTING FAGOTIPIFICACIÓN

69 Sondas de DNA para identificar bacterias

70 Warshauer D., Monson T. (2004)

71 E. coli O157:H7 (EHEC) Positivo  Confirmación bioquímica  Confirmacion serológica (O y H)  Presencia de toxina Shiga (por citotoxicidad o ELISA)  Presencia de genes de toxina Shiga (PCR o sondas)

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73 Criterios y métodos taxonómicos para clasificación e identificación de bacterias Criterio o Método Utilizado para ClasificaciónIdentificación MorfologíaXX TinciónXX P. bioquímicasXX SerologíaX FagotipificaciónX Perfiles de ácidos grasosX Composición Bases DNAX Huella del DNA (análisis de restricción) XX PCRXX Hibridación de Ácidos NucleicosXX Secuenciación de rRNAX

74 Sistemas comerciales rápidos para detección y confirmación de Listeria

75 -

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS - Espectrometría de masas MALDI-TOF: MALDI por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización por láser asistida por matriz) y TOF por el analizador Time of Flight (tiempo de vuelo) que se integra típicamente con fuentes de ionización MALDI. - Permite identificación bacteriana a nivel de género y especie (y en determinados casos también subespecie). - Se obtiene un espectro de masa compuesto por los diferentes picos (masa/carga) obtenidos tras la ionización y desorción de los péptidos y pequeñas proteínas característicos de cada especie bacteriana. El espectro con un rango entre Da, representa de manera predominante a las proteínas ribosómicas (conservadas y abundantes). Esta “huella peptídica” es característica de cada proteína y permite identificarla de forma inequívoca al compararla con los espectros de masa incluidos en las bases de datos del MALDI-TOF. 76

Imagen modificada de Croxatto et al. (2012) Espectrometría de masas MALDI-TOF -Analito y matriz cocristalizan - Ingreso de la placa metálica al espectrómetro de masas donde es bombardeada por pulsos de luz láser para producir la desorción e ionización de las moléculas que son aceleradas por medio de un campo electrostático. - En analizador TOF, los iones más pequeños viajan más rápidamente que los iones más grandes. - Detector recepta los iones y produce un espectro, específico para cada analito, que se compara con una base de datos para la identificación de género, especie o cepa. 77

78 Diferentes perfiles de proteínas obtenidas para diferentes bacterias por MALDI-TOF MS (cortesía bioMerieux). García et al, 2012

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