DETECCION DE TROPHERYMA WHIPPLEI EN MATERIALES CLINICOS POR PCR Y SECUENCIACION DEL GEN hps65 Callejo, R; Prieto, M; Aguerre, L; Rocca, F; Martínez, C; Cipolla, L Servicio Bacteriología Especial - Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.Buenos Aires. Argentina. INTRODUCCION La enfermedad de Whipple (EW) es una infección bacteriana crónica, multisistémica y curable que afecta principalmente a hombres caucásicos de mediana edad. El análisis filogenético de la secuencia del gen 16S rARN de la bacteria causal de EW, denominada Tropheryma whipplei (Tw), permitió clasificarla como miembro de las bacterias gram positivas con alto contenido G+C. El tracto gastrointestinal es el órgano más frecuentemente afectado, con manifestaciones tales como; dolor abdominal, síndrome de mala absorción con diarrea y pérdida de peso. Otros signos incluyen febrícula, linfoadenopatía, hiperpigmentación de la piel, endocarditis, pleuritis, artritis seronegativa, uveítis, espondilodiscitis y manifestaciones neurológicas y estos signos pueden presentarse en ausencia de manifestaciones gastrointestinales. Debido a la amplia variedad de manifestaciones, el diagnóstico clínico es muy dificultoso y frecuentemente realizado después de años y aún décadas de que los síntomas iniciales aparezcan. En la mayoría de los pacientes, la tinción de ácido periódico- Schiff (PAS) de biopsias de intestino delgado proximal revela inclusiones dentro de los macrófagos, correspondientes a estructuras bacterianas. Comunicaciones recientes han demostrado que Tw puede ser cultivada en una variedad de líneas celulares humanas. Sin embargo, debido a las dificultades técnicas con el cultivo, la PCR es el método preferido para confirmar la presencia de Tw en materiales clínicos. Varios sistemas de PCR han sido desarrollados para identificar parte del 16S rADN, el espacio intergénico 16S-23S (ITS), o del 23S rADN. Detectar el gen hsp65 de Tw en materiales clínicos de pacientes con sospecha de EW mediante PCR “seminested” y posterior confirmación de Tw por secuenciación del segmento amplificado. OBJETIVO RESULTADOS MATERIALES Y METODOS La amplificación de gen hsp65 fue positiva en 3 pacientes, particularmente en las 3 biopsias de duodeno, confirmándose Tw por secuenciación del gen amplificado. Figura A (PCR 1er. Round) Figura B (PCR 2do. Round) Lineas 2, 6 y 9 muestras de pacientes positivos para Tw. Lineas 3, 4, 5, 7, 8, 10 y 11 muestras negativas. Lineas 1 y 12 marcadores moleculares. Se estudiaron 10 materiales clínicos de 5 pacientes con sospecha de EW. Las muestras fueron: 3 LCR, 3 biopsias de duodeno en parafina, 1 biopsia de duodeno fresca y 1 en formol y 2 sangre. El ADN fue extraído según protocolos conl QIAamp tissue DNA minikit y del QIAamp blood DNA minikit (QIAGEN) . Los primers utilizados para la amplificación del gen hsp65 fueron: whipp-frw1 (5‘-TGACGGGACCACAACATCTG-3'), whipp-frw2 (5'-CGCGAAAGAGGTTGAGAC TG-3'), whipp-rev (5'-ACATCTTCAGCAATGTAAGAAGTT-3'). El gen de la β globina humana fue ensayado en paralelo para cada material como control de inhibidores de PCR. La posición y el tamaño de los productos esperados de la amplificación parcial del gen hsp65 de Tw se muestran a continuación. El amplificado final fue secuenciado mediante el método BigDye terminator utilizando el Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las depositadas en la base de datos del GenBank, utilizando el BLAST Software 2.2. Paciente Muestra Coloración de PAS PCR Secuenciación 1 LCR Negativo Biopsia de duodeno (fresco) No determinado 2 Biopsia de duodeno (formol) 3 sangre >99% Tw duodeno (parafina) Positivo 4 5 Heat shock protein 65 728 872 663 1231 1er. round 500 pb whipp-frw1 2do. round whipp-frw2 357 pb whipp-rev 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 622 527 404 307 622 527 404 307 500 pb 327 pb Estrategia para el diagnóstico de la Enfermedad de Whipple utilizando coloración de PAS y PCR CONCLUSIONES Manifestaciones clínicas Sospecha de enfermedad de WHIPPLE localizada Selección de muestras analizadas con coloración de PAS y PCR basado en manifestaciones clínicas Artritis: líquido sinovial o biopsia Linfoadenopatías: glanglios linfáticos Manifestación neurológica: LCR si negativo  biopsia cerebral Uveitis: humor acuoso Endocarditis: válvula cardiaca Espondilodisquitis: biopsia de disco PAS positiva PAS y PCR positivas PCR positiva Posible enfermedad de WHIPPLE Enfermedad Un diagnóstico de laboratorio confiable es fundamental, dado que la EW no tratada puede llevar a la muerte y las terapias antimicrobianas adecuadas para enfermedades con presentación clínica similar, difieren significativamente en la elección de la droga y duración del tratamiento. Esta PCR constituye el primer paso en la identificación de Tw en materiales clínicos y el objetivo futuro es la implementación de una PCR en tiempo real como una herramienta diagnóstica con mayor sensibilidad para el diagnóstico de la EW. Sospecha de enfermedad de WHIPPLE Biopsia de intestino delgado con coloración de PAS y PCR PAS positiva PAS y PCR positivas PCR positiva Posible enfermedad Enfermedad