2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR DESALADO

¿Qué es una proteína?.....

Una proteína es… “Es una macromolécula compuesta por una o mas cadenas polipeptídicas, cada una compuesta por una secuencia característica de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos”. (Principios de Bioquímica, Lehninger)

¿Qué funciones tienen las proteínas?

Las funciones biológicas de las proteínas Las proteínas tienen diferentes funciones: Enzimas (Actividad catalítica) Receptores de membrana Transportadores y Acarreadores de membrana (Reconocimiento, actividad catalítica y transporte) Estructurales (Andamios moleculares) Hormonas Anticuerpos Transporte

Pasos en la Purificación de Proteínas La purificación de proteínas es un proceso mediante el cual se separa una proteína a partir de una mezcla compleja. El método de purificación debe diseñarse tomando en cuenta la cantidad de proteína que queremos obtener (rendimiento). Este rendimiento depende del uso que se le desea dar Para la purificación se toman en cuenta las propiedades fisicoquímicas y se hace mediante métodos cromatográficos en un proceso paulatino. Podemos obtener la proteína en estado nativo o desnaturalizado dependiendo la finalidad de la purificación: Para evaluar la actividad biológica se requiere en estado nativo Para determinar su estructura primaria, puede estar desnaturalizada

Localización subcelular Características que debemos tomar en cuenta para purificar una proteína… Para qué queremos purificar la proteína: Actividad Concentrarla Purificarla Propiedades de la proteína: Masa Molecular Punto Isoeléctrico Solubilidad Estabilidad De donde vamos a obtener la proteína: Localización subcelular Tejido Organismo Que técnica vamos a usar para purificar. (Dependiendo de que queremos analizar) Cuidados de la muestra durante la purificación.

Las proteínas se pueden purificar para diferentes finalidades: Investigación Estudiar su función biológica. Evaluar la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. Hacer análisis filogenéticos. Analizar la relación estructura-función. Biotecnología Aplicaciones médicas. Aplicaciones terapéuticas. Suplementos alimenticios Detergentes y limpiadores. Cosméticos

Propiedades de la proteína… Masa Molecular: Conocer el tamaño de la proteína es importante cuando hacemos un gel SDS-PAGE o métodos cromatográficos para purificar la proteína como filtración en gel. Punto Isoeléctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar adecuadamente el buffer a utilizar o técnicas como precipitación isoeléctrica o cromatografía de intercambio iónico. Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las proteínas, tales como la composición de aminoácidos, la estructura tridimensional y factores externos como pH, temperatura, fuerza iónica. Estabilidad: Las características físicas y químicas de la proteína son importantes para la purificación, en términos de agregación, actividad, etc. Polaridad: La hidrofobicidad de la proteína nos permite seleccionar técnicas de purificación como columnas de interacción hidrofóbicas o en aspectos de extracción de proteínas. Uniones específicas: Algunas proteínas tienen unión a ligandos que permiten usar técnicas de purificación como la cromatografía de afinidad.

Para purificar la mayor cantidad de proteína se requiere tomar en cuenta varios aspectos como: El tejido del cual vamos a obtener la proteína. La elección debe tener en cuenta tres aspectos importantes: Disponibilidad. Cantidad de tejido necesario para obtener suficiente proteína. Cantidad de proteína. Cuanta proteína de interés encontramos en el tejido que vamos a analizar. Para obtener un mayor rendimiento se necesita: Rendimiento y Pureza Por lo que… Degradación y Desnaturalización Características de la proteína. Que nos ayuden en el proceso de purificación.

Técnicas de purificación según las propiedades de las proteínas: Solubilidad: Precipitación. Carga iónica: Cromatografía de intercambio iónico. Tamaño Molecular: Electroforesis en gel. Centrifugación diferencial. Diálisis. Cromatografía de filtración en gel. Polaridad: Cromatografía de interacción hidrofóbica. Uniones específicas: Cromatografía de afinidad.

Métodos generales para obtención de proteínas: Ruptura del material Obtención del material libre de células (extracto proteico) Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos) Concentración (diálisis o ultracentrifugación) Fraccionamiento cromatográfico.

Ruptura del material. Lisis celular. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica. Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando hinchamiento y ruptura. Destrucción mecánica. Homogenización: hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente. Mortero: moler en un mortero usando arena o alúmina. Molino con piedras de vidrio. Prensa de French: hacer pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio. Sonicación: Someter las células a vibraciones ultrasónicas. Congelación y descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196°C (usando nitrógeno líquido) y pasándolos rápidamente a temperatura ambiente (25°C).

Inhibidores de proteasas. Amortiguador de lisis Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible. Para ayudar a mantener las condiciones apropiadas e incluso mejorar la estabilidad de una proteína un buffer de lisis debe tener las siguientes características: pH Mantener el pH en el cual la proteína es estable y previene la precipitación isoeléctrica. Fuerza Iónica Mantener la concentración de sales adecuada para reducir las pérdidas por precipitación. Aditivos Son componentes que previenen la degradación y mejoran la estabilidad. Sólo se agregan sin son necesarios y bajo las condiciones de la extracción. Agentes quelantes. Detergentes Inhibidores de proteasas.

Algunos Aditivos según el tipo de proteína

2. Obtención de material libre de células (extracto proteico) El resultado de los tratamientos de lisado u homogenizado contiene una mezcla de enzimas membranas y células rotas. Esta mezcla se somete a centrifugación para eliminar los restos celulares y separar el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles. El extracto soluble con o sin detergente constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos.

¿Qué propiedad de la proteína es importante en la precipitación? Masa Molecular: Conocer el tamaño de la proteína es importante cuando hacemos un gel SDS-PAGE o métodos cromatográficos para purificar la proteína como filtración en gel. Punto Isoeléctrico: Es una valor importante que nos permite seleccionar adecuadamente el buffer a utilizar o técnicas como precipitación isoeléctrica o cromatografía de intercambio iónico. Solubilidad: Diversos factores afectan la solubilidad de las proteínas, tales como la composición de aminoácidos, la estructura tridimensional y factores externos como pH, temperatura, fuerza iónica Estabilidad: Las características físicas y químicas de la proteína son importantes para la purificación, en términos de agregación, actividad, etc. Polaridad: La hidrofobicidad de la proteína nos permite seleccionar técnicas de purificación como columnas de interacción hidrofóbicas o en aspectos de extracción de proteínas. Uniones específicas: Algunas proteínas tienen unión a ligandos que permiten usar técnicas de purificación como la cromatografía de afinidad.

3. Precipitación Debido a los grupos cargados de las proteínas, la solubilidad se altera aumentando o disminuyendo cuando se modifican factores como el pH, temperatura y fuerza iónica. Los métodos de precipitación son: Precipitación con solventes orgánicos. Precipitación isoeléctrica Precipitación térmica Precipitación salina

La precipitación salina de las proteínas es una técnica donde se precipita una fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-H2O porque quita la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Sin embargo el método más utilizado es la precipitación por salado con (NH4)2 SO4

Precipitación con sulfato de amonio El sulfato de amonio (NH4)2SO4 presenta una gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C) y es un ión divalente que alcanza altas fuerzas iónicas. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.

Salting in. Es el fenómeno por el cual la concentración de sal aumenta la solubilidad de la proteína. Al aumentar la concentraciones se reducen las fuerzas electrostáticas. Cuando a un sistema proteico se le adicionan sales neutras en concentraciones menores a 1.0 M, las proteínas incrementan su solubilidad. Los cationes y aniones reaccionan con los grupos ionizables de las proteínas impidiendo las interacciones entre las cadenas laterales o extremos terminales cargados de las proteínas. Salting out. A medida que se aumentan las concentraciones de sales en el medio, las interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las interacciones de la proteína con el medio (agua), por lo que precipitan A concentraciones mayores a 1.0 M, las proteínas tienden a precipitar.

3. Concentración de proteínas La concentración es proceso mediante el cual reducimos el volumen del solvente en el que se encuentra la proteína y así aumentar la cantidad de proteína por volumen. La concentración de las proteínas puede llevarse a cabo mediante dos técnicas principalmente: Diálisis Ultracentrifugación

Diálisis Técnica que consiste en separar de una mezcla los componentes de una disolución, ya sea para eliminar impurezas como sales o moléculas pequeñas a través de una membrana.

Ultracentrifugación Concentración de una muestra mediante centrifugación.

Centrifugación diferencial Es una técnica en la cual se aplica la fuerza centrifuga para separar partículas. Esta basado en el coeficiente de sedimentación.

Práctica: Purificación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) de músculo esquelético de pollo.

La lactato deshidrogenasa (LDH): Su función es oxidación de lactato a piruvato Es una enzima que se encuentra en casi todos los tejidos. (Hígado, corazón, vasos sanguíneos, riñones, bazo, páncreas, pulmones, cerebro y músculo)

Esta formada por 4 subunidades. Se conocen tres tipos de subunidades:  H (LDHB), M (LDHA) y X (LDHC), que presentan pequeñas diferencias en su secuencia de aminoácidos. Su coenzima es la vitamina B. Sus subunidades tipo H y M pueden asociarse de manera que puede formar 5 isoenzimas. Las diferentes isoenzimas pueden encontrarse en diferentes tejidos : LDH-1 (H4): Corazón, músculo, eritrocitos. LDH-2 (H3M): Sistema retículo endotelial, leucocitos. LDH-3 (H2M2): Pulmones. LDH-4 (HM3): Riñones, placenta y páncreas. LDH-5 (M4): Hígado y músculo esquelético.

Investigar: Propiedades de la lactato deshidrogenasa de pollo (lactate deshydrogenase from Gallus gallus isoformas A o B): Localización subcelular Secuencia primaria de aminoácidos pI (punto isoeléctrico) Número de residuos cargados positivamente y negativamente Actividad enzimática Peso molecular Estructura terciaria y/o cuaternaria Ligas: http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.uniprot.org/uniprot/P00340 http://www.expasy.org http://www.uniprot.org/ http://www.brenda-enzymes.info/ Para determinar pI y número de residuos de aminoácidoscargados http://web .expasy.org/compute pi/

Parte A. Extracción. 1. Cortar en trozos pequeños 80g de pechuga de pollo (eliminar la grasa y tejido conectivo) 2. Agregar 3 volúmenes de amortiguador A frío por cada gramo de tejido y licuar en pulsos de 3 seg./3 a 6 veces. 3. Filtrar la mezcla con gasa. Se obtiene la fracción F0. 4. Distribuir el filtrado en botellas de centrifuga y centrifugar a 7,000 RPM a 4°C durante 10 min. Recuperar el sobrenadante (F1). Almacenar 1mL a -20°C. Parte B. Precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4. 5. Tomar 25 mL de la fracción 1 y colocarlos en un vaso de precipitado. 6. Agitar en hielo el sobrenadante de manera continua y suave. Agregar el sulfato de amonio sólido (8.5 g), Agitar vigorosamente. 7. Saturación del 55% de sulfato de amonio. 8. Centrifugar la mezcla turbia a 10,000 RPM a 4°C durante 10 minutos. 9. Recolectar el sobrenadante (Fracción 2) y registrar el volumen. Tomar una alícuota de 1 mL y almacenar a -20°C. 10. Realizar una segunda precipitación con(NH4)2SO4 al 75% de saturación. Repetir paso 6 y 7. 11. Repetir paso 8. 12. Resuspender el pellet en 1 mL de agua. 13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Almacenar a -20°C.