Universidad de Concepción facultad de Cs. Naturales y Oceanográficas Métodos de cuantificación de la biomasa microbiana en la columna de agua Cristián Chandía V. Paulina Contreras D. Cristóbal Bravo M.

BIOMASA Se refiere a la cantidad de materia viva existente por unidad de volumen o por unidad de superficie. Se puede medir y expresar su valor mediante diferentes métodos como el peso fresco total ó el peso seco total, entre otros. La biomasa microbiana esta en directa relación, al igual que la de los demás organismos, con la cantidad de nutrientes disponibles para metabolisar. Por lo dificil que resulta pesar los microorganismos es que se ha optado por obtener relaciones directas entre recuento directo y peso total. Ahora, con el desarrollo de nuevas tecnologías se puede obtener valores mas reales de la masa utilizando como indice proteínas o compuestos orgánicos presentes en las células.

Métodos para la determinación de biomasa microbiana El peso seco El peso húmedo Determinación de ácidos nucleicos Determinación de Nitrógeno Incorporación de precursores radioactivos Recuento microscópico por epifluorescencia Mediante la determinación de ATP

PESO SECO El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.

PESO HUMEDO Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra( por lo mismo que el anterior).

DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente ADN) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

DETERMINACION DE NITROGENO Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-,NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la digestión de Kjeldahl.

INCORPORACION DE PRECURSORES RADIACTIVOS Es un técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En este técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población.

RECUENTO MICROSCOPICO POR EPIFLUORESCENCIA Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuento, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y teñidas con colorantes fluorescentes (por ejemplo naranja de acridina).

DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA A TRAVÉS DE LA DETERMINACIÓN DEL ATP Se calcula la biomasa a través de una relación directa con la cantidad de ATP de la muestra. Relativamente contemporáneo y de fácil entendimiento.

PROTOCOLO DE TRABAJO Muestreo Extracción de ATP Activación de la solución enzima-sustrato (luciferin-luciferasa) Lectura de muestras

MUESTRAS: Se toma una muestra de agua con instrumentos especiales (botella de Niskin, Nansen u otros). Se filtra por un tamiz de 400 um, donde todo lo que pase este proceso de filtrado se considera microorganismo. Se filtra nuevamente en un filtro Whatman.

EXTRACCION DEL ATP: Se sumerge el filtro en 3 ml de solución tampón Tris-HCl hirviendo (Hidroximetil-aminometano + ácido clorhídrico) Se deja hervir por 5 minutos (~100ºC). Se agrega agua destilada para conservar el volumen (3 ml) Se congela a -20ºC hasta la lectura de la muestra.

Reacción entre luciferina y ATP Oxiluciferina + CO2 + AMP + P-P + LUZ Luciferina + O2 + ATP luciferasa

Gráfico de intensidad lumínica vs tiempo

Ventajas del método estudiado. La distribución universal del ATP en todas las células vivas. La rápida pérdida de éste en las células muertas. Concentración relativamente constante en la mayoría de los organismos (aprox. 2 mM en células activas). Fácil extrapolación a variados parámetros de biomasa.

Desventajas de este método Poca objetividad ya que el ATP no discrimina. Riesgos de perdida de material biológico durante la preparación de la muestra. Errores en la calibración pueden provocar alteraciones en los resultados. Se entrega un resultado en base a una estimación preconcebida.

BIBLIOGRAFIA: Acuña, A (1982) Biomasa plantoniaca estimada a partir de determinación de ATP y su distribución espacial en el estrecho Bransfield (Antártica). Departamento de Biología Molecular. Universidad de Concepción. Tesis para optar al título de Bíologo Marino. 56 pp. Holm-Hansen, O.; C. Booth. (1966). The measurement of adenosin triphosphate in the ocean and its ecological significance. Limnology and Oceanography. 11:510-519 Madigan, M.; J. Martinko & J. Parker (1999). Brock, Biología de los microorganismos. Octava edición. Prentice Hall Iberia. Madrid. España. 1064 pp. Moffat, C (1999). Distribución de Biomasa y metabolismo por tamaño en un sistema hipereutrófico: Laguna Rocuant, Talcahuano. Departamento de Oceanografía. Universidad de Concepción. Seminario presentado para optar al titulo de Biólogo Marino. 63 pp. Riffo, G.(1983). Variación estacional en la biomasa de Thioploca en la plataforma continental frente a Dichato. Departamento de Oceanografía. Universidad de Concepción. Tesis para optar al titulo de Biólogo Marino

FIN