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Métodos para contar células
Hemocitómetro Basados en la microscopía Tinción de cultivos en monocapa Medidores de la resistencia Métodos para contar células Electrónicos Análisis de imagen Citómetro de flujo Peso Métodos aproximados Contenido de ADN Contenido de proteínas Métodos para contar células
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El hemocitómetro o cámara de Neubauer
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La cuadrícula del hemocitómetro
1 mm Profundidad = 0,1 mm (rojo) (verde) (gris) (amarillo) (azul) La cuadrícula del hemocitómetro
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Se introduce la suspensión de células en el hemocitómetro
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La región de recuento del hemocitómetro
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La cámara de recuento del hemocitómetro
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Recuento de células con el hemocitómetro
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Observación con microscopio óptico y recuento de células
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Diferencias entre células vivas y muertas
De las tres líneas, la del centro es la que corresponde al límite del cuadrado Célula muerta Célula viva Diferencias entre células vivas y muertas
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Tinción de cultivos en monocapa
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Hay tres tipos de contadores electrónicos
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Funcionamiento del contador de células electrónico (1)
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Funcionamiento del contador de células electrónico (2)
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Hay que establecer el rango de tamaños a medir
Es importante poner límites a los tamaños (diámetro celular) que se van a medir. El límite inferior elimina el ruido electrónico y los residuos celulares. El límite superior se pone en 30 micras o en infinito. 7,6 – 50 mm Hay que establecer el rango de tamaños a medir
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El contador distingue las células muertas
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Con este contador no hay que marcar las células
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Recuento mediante análisis de imagen
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Fundamento del recuento de células por análisis de imagen
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Recuento de células por análisis de imagen
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Esquema del análisis de la imagen
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Recuento de células mediante citometría de flujo
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La difracción de luz frontal permite contar las células y, a la vez, nos da información sobre su tamaño. Citometría de flujo
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Estimación del número de células a partir del peso
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Estimación del número de células a partir contenido proteico
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Método de Bradford: fundamento
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Método de Bradford: protocolo
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Estimación del número de células a partir contenido de ADN
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Determinación de ADN por la fluorescencia del H33258
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Estimación del ADN por la absorbancia en el ultravioleta
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Comparación de los diversos métodos para contar células
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Métodos para determinar la viabilidad de las células
Exclusión del azul tripán Marcaje fluorescente con naranja de acridina y ioduro de propidio Métodos para determinar la viabilidad de las células Síntesis de novo de proteínas Incorporación de 3H-timidina al ADN Métodos para determinar la viabilidad de las células
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Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán
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Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán
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Células vivas Células muertas
Naranja de acridina: atraviesa la membrana celular y tiñe los ácidos nucleicos, generando una intensa fluorescencia de color verde a bajas concentraciones. Ioduro de propidio: no atraviesa la membrana de células intactas, pero sí la de las células dañadas. Se une a los ácidos nucleicos, desplazando al naranja de acridina y genera una intensa fluorescencia de color rojo. Células muertas Viabilidad celular: Naranja de acridina + Ioduro de propidio
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Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de proteínas
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Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de ADN
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