Técnicas inmunológicas Técnicas serológicas

Principios de Diagnóstico Inmunológico Las enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas definitivamente solo por tres formas: 1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente conocido capaz de provocar la enfermedad, por observación directa en el material clínico obtenido del paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro) 2) Detección de un producto específico del agente infeccioso (que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el material clínico obtenido del paciente 3) Detección en el suero del paciente de una respuesta inmunológica específica dirigida contra el Agente infecciosos

Características generales de la respuesta inmune  Categorías de la respuesta inmune Respuesta inmune mediada por células o Inmunidad Celular Respuesta inmune mediada por anticuerpos o Inmunidad humoral  Para determinar si se ha producido un anticuerpo contra un agente en particular, se investiga en el suero (o plasma) del paciente la presencia de anticuerpos  El diagnóstico de las enfermedades por la medición de los niveles de anticuerpo en suero se denomina serología

Características generales de la respuesta inmune  Características de los Anticuerpos Mecanismo determinado genéticamente Dirigidos contra un antígeno o determinante antigénico (epítope) Los microorganismos pueden contener numerosos determinantes antigénicos Habrá por lo tanto numerosos anticuerpos para cada antígeno Muchos determinante antigénicos requieren ser expuestos

Características generales de la respuesta inmune  Características de los Anticuerpos Los anticuerpos se unen a la superficie de los patógenos para: ○ Facilitar su ingestión por las células fagocíticas (Anticuerpos opsonizantes u opsoninas)

Características generales de la respuesta inmune ○ Contribuir a su destrucción por la acción lítica del complemento (Anticuerpos fijadores de complemento)

Características generales de la respuesta inmune  Características de los Anticuerpos Aunque el ser humano produce varias clases de anticuerpos los métodos serológicos han sido desarrollados para medir principalmente dos clases: ○ Inmunoglobulina M (IgM) ○ Inmunoglobulina G (IgG) Solo en un caso se han desarrollado métodos para detectar la Inmunoglobulina A (IgA): Toxoplasmosis

Características generales de la respuesta inmune  Características de los Anticuerpos IgG ○ Se producen mas tardíamente pero persisten mas tiempo. ○ Dos imágenes especulares, formadas por dos proteínas, con los sitios de fijación para el antígeno en el extremo. ○ Unión mas espedífica al antígeno (avidez)

Características generales de la respuesta inmune  Características de los Anticuerpos IgM ○ Es el primer anticuerpo producido en respuesta a un antígeno (infección reciente) ○ Cinco proteínas idénticas unidas por la cadena J ○ Unión al antígeno menos avida. ○ No fija complemento

Características generales de la respuesta inmune

 Respuesta humoral relativa frente a un estímulo antigénico

Características generales de la respuesta inmune  Interpretación de las pruebas serológicas El dogma central de la serología es el concepto de aumento de título Título de un anticuerpo es la recíproca de la mayor dilución de suero del paciente en la cual aún se puede detectar el anticuerpo Pacientes con gran cantidad de anticuerpos tendrán títulos altos Dos muestras de suero: período agudo y convalecencia. Se procesan pareados. Un aumento de título de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se considera diagnóstico de infección reciente (aumento de cuatro veces el título) En la actualidad se cuentan con metodologías que permiten manejar valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma cuantitativa

Principios de los Métodos Serológicos La reacción entre un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra él da lugar a un complejo antígeno – anticuerpo Utilizada ampliamente en los laboratorios para la detección y cuantificación de gran cantidad de sustancias en diversos medios biológicos. Reacción Antígeno-Anticuerpo

Reacciones de Aglutinación Cuando el antígeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el complejo antígeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinación El proceso tiene dos fases: unión reversible y aglutinación por formación de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antígenos Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar (Anticuerpos completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos (Anticuerpos incompletos) Se expresan como aumento de título Dan fenómeno de prozona (aglutinación aparente por exceso de antígeno o anticuerpo sin aglutinación

Reacciones de Aglutinación Factores que influyen en las reacciones de aglutinación Carga de las partículas Tipo de anticuerpo Concentración de electrolitos Viscosidad Número de determinantes antigénicos Se emplean tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos. Se pueden hacer de dos maneras: directas o indirectas

Reacciones de Aglutinación Directa Para detección de antígenos Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos Distintos tipos de técnicas según la naturaleza física de soporte Aglutinación al látex: partículas de látex fácilmente visibles Detección en LCR de antígenos de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae Hemaglutinación pasiva: hematíes como soporte Coaglutinación: bacterias muertas como soporte; Staphylococcus aureus expresa la Proteína A capaz de fijar el Fc de los anticuerpos

Reacciones de Aglutinación Directa Para detección de anticuerpos Se pueden hacer en tubo, portaobjetos, placa o pocillo de microplaca Se enfrentan las partículas microbianas (generalmente muertas) en suspensión con el suero del paciente. Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la microplaca Detección de anticuerpos frente a Brucella (Reacción de Huddleson) o Salmonella (Reacción de Widal

Reacciones de Aglutinación Indirecta Para detección de anticuerpos Se adsorben los antígenos en un elemento partículado (partículas de látex, gelatina o bentonita, o células como hematíes humanos, ovinos o de pavo Se enfrentan estos elementos (antígeno + elemento particulado) al suero del paciente. Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca Detección de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus

Pruebas de Antiglobulina Se puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte particulado. Se enfrentan estos elementos (antígeno + elemento particulado) al suero del paciente. Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (anti- gamma) Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca. Útil para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

Reacciones de Inhibición Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar determinadas actividades biológicas en presencia de anticuerpos específicos. Las mas utilizadas son dos: Inhibición de la Hemaglutinación Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis, Adenovirus) se unen a receptores de la superficie de los hematíes provocando su aglutinación. Esta aglutinación puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente Neutralización Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citopático habitual en células de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos específicos.

Pruebas de Fijación de Complemento Se incuba suero del paciente con el antígeno. En presencia de anticuerpos en el suero se forman complejos antígeno-anticuerpo. Se añade una cantidad de complemento (todos los elementos). Si inicialmente se habían formado inmunocomplejos se produce la activación del complemento, consumiendo todos los componentes del sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece. Se agrega un sistema revelador constituido por hematíes unidos a anticuerpos antihematíes (hemolisina) Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a los complejos hematíe-hemolisina y los eritrocitos de lisan. Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnósticos de virus respiratorios

Reacciones de Precipitación Formación de estructuras insolubles por unión ente el antígeno soluble y el anticuerpo específico incapaces de permanecer en solución El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante técnicas de nefelometría o inmunoturbidimetría, que pueden a su vez ser adaptadas a autoanalizadores de química clínica o instrumentos especializados (nefelómetros o inmunoturbidímetros) Se pueden usar para determinar proteínas reactantes de fase aguda como PCR o demostrar infecciones previas por Streptococcus pyogenes por AELO (neutralización lítica de estreptolisina O) También pueden ser observados por tinción en placas de agarosa

Inmunodifusión doble Técnica de Outcherlony Se enfrentan concentraciones conocidas de antígeno soluble con un antisuero problema en un medio gelificado Tras un período en el que se permite difundir a ambos elementos puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de precipitación que pueden ser identificadas a simple vista o mediante tinción proteica Se emplea en la práctica en la detección de anticuerpos frente a diversos hongos productores de neumonitis por hipersensibilidad

Inmunodifusión Radial Técnica de Mancini Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos diluciones del antígeno. Si se corre simultáneamente una curva patrón puede cuantificarse por regresión la cantidad de antígeno. Es mas útil para para la detección de antígenos que de anticuerpos

Contrainmunoelectroforesis Puede ser utilizada tanto para detectar antígenos como anticuerpos Combina la electroforesis (migración de antígenos y anticuerpos en un gel de agarosa por acción de un campo eléctrico) con la precipitación (formación de líneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se produce la reacción antígeno-anticuerpo) El antígeno de carga negativa en medio alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia los pocillos del anticuerpo. Los anticuerpos en estas mismas condiciones migran al polo negativo o cátodo. Se emplea en la identificación del Arco 5 de Echinococcus granulosus

Pruebas con Anticuerpos Fluorescentes Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes (fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de acridina. Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un microscopio de fluorescencia Dos variantes: Técnica directa (para detección de antígenos): se fija la muestra en un portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el florocromo (inmunofluerescencia directa IFD). Detección de Pneumocystis carinii en esputo inducido Técnica indirecta (para detección de anticuerpos): se agrega primero el suero del paciente sobre antígeno improntado en portaobjetos; en la segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

Inmunohistoquímica enzimática Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con enzimas. Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color. Usado para detectar antígeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo pacientes infectados con Rabia

Inmunoensayos Para detectar antígenos – Metodología ELISA Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos, esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc. Se añade la muestra problema con antígeno Se lava para eliminar otras proteínas unidas en la muestra Se agrega un segundo anticuerpo contra el antígeno, unido a un marcador enzimático (una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante). Se agrega el sustrato de la enzima, que dará un color si había antígeno unido Diagnóstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello uterino

Inmunoensayos Para detectar anticuerpos – Metodología ELISA Utilizan antígenos unidos a un elemento sólido (esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al que se le añade suero del paciente. Si el suero tiene anticuerpos específicos se unen a os antígenos. La reacción se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con: Enzima Enzimoinmunoensayo (EIA) Isótopo radioactivo (I 125 )Radioinmunoensayo (RIA) Sustancia fluorescenteFluoroinmunoanálisis (FIA) Se lee la señal con un espectrofotómetro (EIA), contador de centelleo (RIA) o un fluorómetro (FIA)

Inmunotransferencias Inmunobloting o Western Blot Separación de antígeno proteico por electroforesis en gel de poliacrilamida Transferencia del antígeno separado a una membrana de nitrocelulosa Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan los anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana conjugada con una enzima. Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reacción antígeno anticuerpo. Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos. Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de tamizaje por EIA de anticuerpos frente al virus del SIDA