DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL

Presentación del tema: "DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL"— Transcripción de la presentación:

1 DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
ENAS SeraQuest ANTI – SSA ENA – 4 PROF InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL ENA – 6 – SCREEN I

2 SeraQuest ANTI - SSA PROCEDIMIENTO
Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada Leer la absorvancia a 405 nm

3 SeraQuest ANTI - SSA PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Las muestras diluidas son incubadas con el antígeno que esta pegado a los pozos Si los Ac anti – SSA estan presentes en la muestra se uniran al antigeno Los residuos de la muestra son eliminados por lavado y secado Se añade el conjugado (anti – IgG marcada con una enzima) y se incuba la placa Si los Ac anti – SSA estan presentes, el conjugado se unira al complejo Ag – Ac Los residuos del conjugado son eliminados por lavado y secado Finalmente se añade el sustrato y se incuba En presencia de la enzima el sustrato da un producto final de color amarillo, el cual se lee fotometricamente

4 SeraQuest ANTI - SSA E E SUSTRATO E SUSTRATO H2SO4 COLOR

5 ENA - 4 - PROF PROCEDIMIENTO
Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4) Leer la absorvancia a 405 nm

6 ENA - 4 - PROF PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac específicos para ENA del suero se unen al Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca Se incuba con un Ac anti – IgG humano conjugado con peroxidasa Finalmente se añade el cromogeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de hidrogeno (H2O2) Este sustrato dará lugar a un producto soluble de color amarillo La reacción enzimática se detiene con H2SO4 La formación del producto se mide a 450 nm La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción

7 ENA PROF POD POD TMB POD TMB H2SO4 COLOR

8 DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL

9 DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL PRINCIPIO DE LA PRUEBA El InmunoDOT DNA/ENA Autoinmunity Screening Panel utiliza una técnica de marcado puntiforme (dot) de inmunoensayo (EIA) para la detección de Ac Los Ag son dispensados como punteados discretos sobre una membrana sólida Después de adicionar la muestra al envase de reacción, se inserta una cinta de prueba, permitiendo que los Ac del paciente reaccionen con el Ag de prueba para unirse a la membrana sólida de soporte de la cinta En la segunda fase, la reacción es aumentada por el retiro de materiales unidos inespecíficamente Durante la tercera fase los anti – Ac humanos conjugados con la fosfatasa alcalina se dejan reaccionar con los Ac unidos del paciente Finalmente, la cinta es transferida a un reactivo de sustrato enzimático, el cual reacciona con la fosfatasa alcalina unida para producir un punteado diferenciado, fácilmente visible

10 DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL FA FA FA Sustrato Enzimático

11 ENA - 6 - SCREEN I PROCEDIMIENTO
Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4) Leer la absorvancia a 405 nm

12 ENA - 6 - SCREEN I PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac específicos para ENA del suero se unen al Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca Se incuba con un Ac anti – IgG humano conjugado con peroxidasa Finalmente se añade el cromogeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de hidrogeno (H2O2) Este sustrato dará lugar a un producto soluble de color amarillo La reacción enzimática se detiene con H2SO4 La formación del producto se mide a 450 nm La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción

13 ENA SCREEN I POD POD TMB POD TMB H2SO4 COLOR

14 ANTICARDIOLIPINAS Las anticardiolipinas son Ac que van dirigidos contra las cardiolipinas, las cuales son un componente importante de la membrana mitocondrial. Se presentan en las células metabólicamente activas del músculo cardíaco y esquelético. TÉCNICA

15 ANTI – CARDIOLIPIN ANTIBODI
ANTICARDIOLIPINAS QUANTA Lite ACA IgG III QUANTA Lite ACA IgM III ANTI – CARDIOLIPIN ANTIBODI

16 QUANTA Lite ACA IgG III PROCEDIMIENTO
Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4) Leer la absorvancia a 405 nm

17 QUANTA Lite ACA IgG III PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los pocillos de la microplaca contienen Ag cardiolipina altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los Ac anti – cardiolipina al Ag que los recubre El resto de componentes no unidos se eliminan durante el lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los Ac presentes Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado Una vez que se haya detenida la producción enzimática de producto coloreado, se determina la presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina por medio de la comparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración de cinco puntos. Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidades estándar de anticardiolipina IgG (GPL)

18 QUANTA Lite ACA IgG III E E TMB E TMB H2SO4 COLOR

19 QUANTA Lite ACA IgM III PROCEDIMIENTO
Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4) Leer la absorvancia a 405 nm

20 QUANTA Lite ACA IgM III PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los pocillos de la microplaca contienen Ag cardiolipina altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los Ac anti – cardiolipina al Ag que los recubre El resto de componentes no unidos se eliminan durante el lavado y se añade conjugado anti IgM humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los Ac presentes Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado Una vez que se haya detenida la producción enzimática de producto coloreado, se determina la presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina por medio de la comparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración de cinco puntos. Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidades estándar de anticardiolipina IgM (MPL)

21 QUANTA Lite ACA IgM III E E TMB E TMB H2SO4 COLOR

22 ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
PROCEDIMIENTO Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4) Leer la absorvancia a 405 nm

23 ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
PRINCIPIO DE LA PRUEBA Los Ac anti – cardiolipina (ACA) del suero, en presencia de 2 – glicoproteína I, se unen a la cardiolipina adsorbida a la superficie de los pocillos de la microplaca A continuación, se incuba con un Ac anti – IgG o anti – IgM humano conjugado con peroxidasa Finalmente, se añade el cromógeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB)con H2O2, sustrato que da color a un producto soluble de color amarillo La reacción enzimática se detiene con H2SO4 y la formación de producto se mide a 450 nm La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción

24 ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
E E TMB E TMB H2SO4 COLOR

25 TÉCNICA ANAS Los Ac antinucleares (ANAS) constituyen un conjunto de distintos Ac dirigidos contra componentes macromoleculares normales del núcleo celular 5 grupos de ANAS: Ac antinucleoproteínas (complejo DNA - histonas) Ac contra DNA Ac contra Ag nucleares salino extraíbles dirigidos contra los Ag: * Sm (proteína nuclear no asociada con Ag nucleicos) *RNP (ribonucleoproteína) *SS – A/Ro *SS – B/La *Jo – *Scl – 70 Ac contra ácido ribonucleico del nucleolo Ac contra histonas libres

26 ANAS NOVA Lite ANA Plus NOVA Lite HEp - 2

27 NOVA Lite ANA Plus PROCEDIMIENTO
Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la mezcla de sueros. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino) Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y repetir el lavado. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El sustrato debe permanecer siempre húmedo. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7). Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire. Observar al microscopio de fluorescencia

28 NOVA Lite ANA Plus PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se unen a sus correspondientes antígenos Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína Se visualizan por microscopía de fluorescencia Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido

29 NOVA Lite ANA Plus

30 NOVA Lite HEp - 2 PROCEDIMIENTO
Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la mezcla de sueros. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino) Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y repetir el lavado. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El sustrato debe permanecer siempre húmedo. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7). Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire. Observar al microscopio de fluorescencia

31 NOVA Lite HEp - 2 PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se unen a sus correspondientes antígenos presentes en las células HEp-2 Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína Se visualizan por microscopía de fluorescencia Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido

32 NOVA Lite HEp - 2

33 ANTI - DNA Los Ac anti – DNA penetran la célula, reconocen y se unen al DNA de doble cadena o de cadena simple. La penetracion de estos Ac pueden alterar las funciones celulares e inducir la muerte apoptótica de la célula. Uno de los métodos utilizados para la detección de los Ac anti – DNA es la IFI sobre el protozoo Crithidia luciliae, cuyo DNA circular y en formade helice esta contenido dentro de la mitocindria gigante desplazado hacia uno de sus polos, llamado cinetoplasto. TÉCNICAS

34 NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
ANTI - DNA NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae ANTI – ADNn Colorzyme Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn PEROXISET ANTI – DNA

35 dsDNA Crithidia luciliae
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae PROCEDIMIENTO Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la mezcla de sueros. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino) Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y repetir el lavado. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El sustrato debe permanecer siempre húmedo. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7). Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire. Observar al microscopio de fluorescencia

36 dsDNA Crithidia luciliae
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae PRINCIPIO DE LA PRUEBA Los anticuerpos anti – DNA del suero se unen a sus correspondientes antígenos Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína Se visualizan por microscopía de fluorescencia Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido

37 dsDNA Crithidia luciliae
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae

38 Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
PROCEDIMIENTO Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la mezcla de sueros. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino) Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y repetir el lavado. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El sustrato debe permanecer siempre húmedo. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7). Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire. Observar al microscopio de fluorescencia

39 Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
PRINCIPIO DE LA PRUEBA Las muestras de los pacientes se incuban con un sustrato antigénico que permite la unión específica de los autoanticuerpos al ADNn del cinetoplasto Si hay Ac anti – ADNn se forma un complejo Ag – Ac estable Tras el lavado para retirar los Ac unidos de forma inespecífica, se incuba el sustrato con Ac anti- humanos conjugados con fluoresceína Si los resultados son positivos se forma un complejo estable con tres partes: el Ac fluorescente unido al Ac anti – ADNn humano, unido a su vez al Ag anti – ADNn Este complejo se puede visualizar con la ayuda de un microscopio de fluorescencia En las muestras positivas, el cinetoplasto o el núcleo, o los dos, mostrarán una fluorescencia de color verde manzana brillante en el interior de los microorganismos Crithidia luciliae.

40 Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn