UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Presentación del tema: "UNIVERSIDAD VERACRUZANA"— Transcripción de la presentación:

1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA

2 PARASITOLOGÍA LABORATORIO
MÉTODOS DE DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

3 Presentan ASCENCIO JIMENEZ ATAI ZISA DE LA CRUZ SOTO REYNA JUDITH
DENISSE ALOR ANA PAULINA LUIS GONZALEZ PACO ALFREDO RAMOS LARA YOKOBED REYES BONIFANT GERARDO RUIS CIGARROA DANIEL ENRIQUE SAUCEDO MACHUCHO DEKART RAMÓN

4 MENU Exámenes de sangre Muestras fecales Procedimiento formalina-èter
Método de Faust Tinción tricrómica de Wheatley Técnica de Graham Reacciones del colorante tricrómico Métodos de inmunodiagnóstico

5 EXÁMENES DE SANGRE PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR PARÁSITOS DE LA SANGRE SE PREPARAN DOS TIPOS DE PELÍCULA DE SANGRE: PÉLICULAS FINAS: la sangre se distribuye por el portaobjetos en una capa delgada y los eritrocitos estan intactos despues de la tinción. PELÍCULAS GRUESAS: conocida como gota gruesa, la sangre se concentra en una zona pequeña y tiene el grosor de muchas capas de células. Durante la tinción, los eritrocitos se lisan y solo serán visibles los leucocitos y los parásitos. Menú

6 PREPARACIÓN DE PORTAOBJETOS
La sangre para el examen se puede obtener por punción digital. La primera gota , libre de anticoagulante, se utiliza para preparar la película. Las películas, especialmente para el diagnóstico de la malaria, no deben prepararse con sangre con anticoagulante o coagulada. Si se emplea alcohol al 70% para desinfectar el punto de la punción, debe enjuagarse o permitir que el alcohol se seque para asegurar que no fija las células hemáticas y evitar una deshemoglobinización en las películas finas

7 Un método alternativo consiste en reunir algunas gotas pequeñas con el borde del porta.
Las películas gruesas pueden prepararse tocando la superficie inferior de una gota de sangre con la punta del dedo y rotando el porta hasta cubrir una superficie del tamaño de 1,5 cm. Las películas gruesas o finas pueden prepararse en portas diferentes o en el mismo con una película fina en un extremo y una gruesa en el otro. En estos casos, solo la película fina se debe fijar con alcohol metílico (30 seg.)Y ha de evitarse el contacto de la película gruesa con el vapor del alcohol. Las películas gruesas deben dejarse secar a temperatura ambiente, generalmente durante le noche. Un exceso de temperatura puede fijar los eritrocitos y evitar la deshemoglobinización.

8 TINCIÓN La tinción se realiza especialmente con el colorante de Giemsa. Para las capas finas se puede utilizar la tinción de Wright, aunque tiñe los parásitos peor que el colorante de Giemsa. En la actualidad se dispone de una serie de tinciones de “Giemsa rápidas”; sin embargo, éstas no tiñen los parásitos del paludismo como el método de Giemsa tradicional. Una solución de Colorante de Giemsa que actúe adecuadamente debe prepararse cada día diluyendo el colorante de Giemsa con agua tamponada con fosfato M/15, pH 7 a 7,2. Se mezclan una parte del colorante con 50 partes de agua en un tarro de Coplin y se tiñen los portaobjetos durante 50 min.

9 Después de la tinción, las películas se enjuagan sumergiendo brevemente los portas en agua tamponada. Se deja secar los portas al aire y después se examinan con iluminación tenue para buscar microfilarias y con alta intensidad lumínica e inmersión en aceite para buscar protozoos en la sangre y los tejidos

10 MUESTRAS FECALES Recogida Y Manipulación De Las Muestras
Examen General Exámenes Microscópicos Menú

11 MUESTRAS FECALES El diagnostico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se realice la toma, manejo y envío de muestras. Los laboratorios que realizan exámenes de heces para detectar parásitos deben ser capaces de efectuar exámenes directos, un procedimiento de concentración y un método de tinción permanente.

12 TOMA DE MUESTRAS Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermética que permitan su fácil transporte. Las heces obtenidas del suelo, excusado así como del pañal no son satisfactorias, debido a que pueden contaminarse con material extraño.

13 Recolección de muestras en adultos y niños
Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plástico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento. Deberá seleccionarse una muestra del tamaño del hueso de un durazno (en caso de heces sólidas); o 1 ó 2 tomas con cuchara (en caso de diarreas)

14 Recolección de muestras en bebés y niños pequeños en pañales
Se debe cubrir el pañal con un envoltorio plástico de manera que las heces queden separadas de cualquier salida de orina. Deberá seleccionarse con una cuchara de 1 a 2 gramos de heces, las cuales serán depositas en el envase en el que se transportarán.

15 Transporte de Muestras
El recipiente que contiene la muestra debe enviarse al laboratorio antes de transcurridos 30 minutos si no contiene conservador.

16 EXAMEN GENERAL Se realiza a simple vista, para ello se extienden las heces en una placa de Petri y se observa: Cantidad Color Olor Forma y Consistencia También podemos observar a simple vista fragmentos de fécula, grasas neutras, moco, pus, sangre, etc.

17 EXÁMENES MICROSCÓPICOS
Las muestras pueden ser observadas microscópicamente mediante montajes húmedos directos de material fresco o conservado, montajes concentrados o tinciones permanentes. Cada procedimiento tiene sus ventajas especificas:

18 Montajes Húmedos Los montajes húmedos directos en suero fisiológico de heces frescas permiten la detección y observación de trofozoitos protozoarios y larvas de helmintos móviles. Los montajes directos de heces conservadas pueden permitir la detección de parásitos que no se concentran bien.

19 Montajes Concentrados
Los procedimientos de concentración aumentan la probabilidad de detectar quistes de protozoos y los huevos y las larvas de helmintos, pero por lo general no son satisfactorios para la detección de los trofozoitos protozoarios.

20 Tinciones Permanentes
Las tinciones permanentes son útiles para la detección y el examen morfológico de los trofozoitos y quistes de los protozoos

21 Exámenes Microscópicos
Las muestras de heces formadas han de ser examinadas por concentración. Las heces blandas y diarreicas deben examinarse por concentración y procedimientos de tinción definitiva. En caso de que sean recientes se examinarán por preparación húmeda directa. Las deposiciones acuosas se examinaran mediante tinciones permanentes y preparaciones húmedas directas.

22 EXÁMENES MICROSCÓPICOS
Montajes Húmedos Procedimientos De Concentración

23 MONTAJES HÚMEDOS Los montajes húmedos directos o de material concentrado se realizan utilizando portaobjetos de 5 por 7,5 cm. y un cubreobjetos del no. 1 de 22 mm. Se realizarán dos montajes, uno sin teñir y otro teñido con una gota d solución yodada. El yodo debe ser de Dobell y O´Connor o una dilución yodada al 1:5 de Lugol. El montaje sin teñir de heces frescas se debe realizar en suero fisiológico (0,85%)

24 Se debe examinar microscópicamente el preparado de tal modo que sea observada sistemáticamente toda la superficie del cubreobjetos. Un método consiste en empezar en un ángulo y utilizando la platina, mover arriba y debajo de tal modo que cada campo pueda ser observado metódicamente con el objetivo de X 10 y X 40

25 PROCEDIMIENTOS DE CONCENTRACIÓN
Los procedimientos de concentración aumentan la capacidad de detección de quistes de protozoos y huevos y larvas de helmintos mediante la disminución del material de fondo en la preparación y una concentración real de los organismos. Los procedimientos de concentración se pueden llevar a cabo en muestras frescas o conservadas.

26 Los métodos de concentración emplean generalmente la sedimentación o la flotación.
En la sedimentación los parásitos mas pesados se depositan en el fondo debido a la gravedad o centrifugación. En la flotación los parásitos suben a la superficie de una solución de alto peso especifico.

27 Los procedimientos mas utilizados son:
La técnica de flotación centrifuga con sulfato de cinc, de Faust La técnica de sedimentación en formalina – éter de Ritchie o sus modificaciones.

28 La técnica de sedimentación con formalina – éter tiene una mayor sensibilidad para detectar la mayoría de los parásitos, pero requiere el uso de éter, lo cual puede presentar problemas de conservación, manipulación y realización.

29 El método de sulfato de cinc – formol resulta eficaz ya que la fijación en este ultimo hace que disminuya la distorsión de huevos, quistes y larvas, y evita el hinchamiento de los opérculos, problemas que pueden surgir si se utiliza una concentración de sulfato de cinc con la muestra en fresco.

30 formalina-éter Procedimiento de la Menú

31 Introduccion Es un procedimiento de concentración
Eficaz en la obtención de: Quistes de protozoos Huevos y larvas de helmintos Sin embargo pueden pasar inadvertidos: Los huevos de Hymenolepsis nana La concentración de Giardia lamblia no sea buena

32 Paso 1 Desmenúcese una porción de unos 2cm de diámetro en suero fisiológico suficiente

33 Paso 2 Se cuelan unos 10ml de la suspensión a través de un embudo con dos capas de gasa húmeda Se coloca en una centrifugadora

34 Paso 3 Centrifúguese durante 1 a 2 minutos a 650g.
Decántese el liquido sobredrenante

35 Paso 4 Resuspéndase el sedimento en suero fisiológico fresco, centrifúguese y vuélvase a decantar.

36 Paso 5 Se añaden unos 9 ml de formalina al 10% al sedimento.
Se mezcla bien y se deja reposar 5 min.

37 Paso 6 Se añaden 3 ml de acetato de etilo, se tapona el tubo y se sacude vigorosamente durante por lo menos 30 seg.

38 Paso 7 Centrifúguese durante 1 min. A 450-500 g.
Se deben formar cuatro capas, como sigue: Capa de acetato de etilo Tapón de desechos Capa de formalina Sedimento

39 Paso 8 Extráigase el tapón de residuos de los lados del tubo mediante un bastoncito aplicador y decántese cuidadosamente para eliminar las tres capas superiores.

40 Paso 9 Con una pipeta se mezclara el sedimento restante con la pequeña cantidad de liquido que se desliza por las paredes del tubo Se preparan montajes sin teñir y coloreados con yodo Se procede a su examen microscópico

41 Paso 10 Se preparan montajes sin teñir y coloreados con yodo
Se procede a su examen microscópico

42 PROCEDIMIENTO DE FLOTACIÓN CON FORMALINA-SULFATO DE CINC.
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43 El formol hace que la muestra sea mas clara y evita el estallido del opérculo y la distorsión de los parásitos. Este método nos da buenos resultados para reconocer los huevos de esquisostoma.

44 1.-Se cuela la suspensión bien mezclada de suspensión fecal a través de una capa de gasa en un tobo con fondo redondeado de 100 por 16 mm hasta 2 mm del borde ( la muestra debe haber sido fijada en formalina por lo menos 30min.)

45 2. - Centrifúguese durante 3,5 min. a 750 g
2.- Centrifúguese durante 3,5 min. a 750 g. se debe utilizar una centrifugadora de suspensión libre.

46 3.- Decántese el sobrante de cada tubo, viértase la ultima gota sobre una sección limpia de una toalla de papel y colóquese el tubo recto en un estante de tubos.

47 4. - Añádase sulfato e cinc hasta 2,5 cm. del borde de cada tubo
4.- Añádase sulfato e cinc hasta 2,5 cm. del borde de cada tubo. Para preparar la solución de sulfato de cinc de disuelven 400 g de ZnSO4 en 1L de agua . Se comprueba el peso especifico con un buen hidrometro y se ajusta si es necesario. Se conserva en un recipiente herméticamente cerrado.

48 5.- Se mezcla el sedimento por completo con dos bastoncillos de aplicación hasta que no queden fragmentos gruesos.

49 6. - Inmediatamente se centrifuga durante 1 o 1. 5 min
6.- Inmediatamente se centrifuga durante 1 o 1.5 min. a 500 g en una centrifugadora de suspensión libre.

50 7.- Así que la centrifugadora se ha detenido por completo, se colocaran los tubos en un estante. Debe evitarse alterar la película de la superficie, que ahora contiene los parásitos flotantes.

51 8.- Se dejara reposar los tubos por 1 min; entonces, se trasfieren dos contenidos de un asa de película superficial a las gotas correspondientes desuero fisiológico o de yodo de Dobell y O’Connor en un porta objetos de vidrio de 5 x 7cm. El asa de metal debe estar en un ángulo recto con el soporte metálico. Tóquese cuidadosamente el la película con el asa sin introducirla en el liquido y deposite la gota del asa junto al suero fisiológico. Entonces, utilizando la base del asa, mezcle las gotas de materia fecal con el suero y luego con la solución yodatada.

52 9.- Colóquese un cubreobjetos de 22 a 30mm, sobre el montaje liquido, evitando atrapar burbujas de aire.

53 10..- Flaméese el asa metálica y procédase entonces a realizar los pasos 8 y 9 en el tubo siguiente.

54 11..- Colóquese cada montaje preparado en el portaobjetos en una placa de Petri que contenga un papel mojado para evitar la desecación.

55 12.- Examínese los montajes inmediatamente o por lo menos antes de 1 hora. Un tiempo de conservación más dilatado puede hacer difícil la identificación de algunos estadios.

56 TINCIÒN TRICRÒMICA DE WHEATLEY
Permite colorear las estructuras internas de protozoos para su caracterización. Utiliza muestras fecales frescas, preservadas con PVA o fijadas con Schaudinn. Método rápido y sencillo y de utilidad en el estudio de: Entamoeba Balantidium Giardia Criptosporidium Menú

57 Materiales Láminas portaobjetos Cytoseal Laminillas cubreobjetos Xilol
Asa de platino Alcoholes 85%,90%. Estilete curvo o pinza curva Colorante chromotrope Acido acético Agua destilada Tintura de Yodo Solución Schaudinn Frascos coplin o placas petri.

58 Procedimiento Preparar un set de placas petri con los reactvos correspondientes. Sujetar la laminilla con el porta laminillas y con el estilete hacer el frotis fino de la muestra sobre la laminilla. Fijar la muestra con solución Schaudinn por 2 a 5 minutos. Pasar por alcohol 70% con 2 o 3 gotas de tintura de yodo. Pasar por 1 minuto por alcohol 70%

59 Pasar por l colorante chromotrope 8 a 15 minutos
Pasar por alcohol 90% con ácido acético al 1% por seg. Y ver tono de coloración. Pasar por alcohol 95% y alcohol absoluto por 3 minutos. Pasar por xilol 1-5 minutos. No debe verse opaco. Realizar el montaje con cytoseal.

60 Observar con objetivo de inmersión 100x.
Observación Observar con objetivo de inmersión 100x. El citoplasma de los parásitos se tiñe de color verde y el núcleo de color rosado. Tinción de Wheatley elaborada a partor de muestra fecal fijada con APV

61 Resultado. Informar el nombre del parásito y su estadio evolutivo.

62 TECNICA DE GRAHAM PARA LOMBRICES
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63 Procedimiento: Se coloca un trozo de cinta de celulosa transparente de una longitud de 6 a 7 cm en un porta de cristal, comenzando en uno de sus extremos. Una pequeña porción del extremo se dobla sobre si misma, lo que permite una superficie no pegajosa para poder mantener la tira con la mano.

64 Para obtener una muestra, se tira del extremo doblado, de tal manera que el extremo adhesivo de la cinta quede libre, dejando suficiente espacio del porta.

65 Se pone la cinta sobre el final del porta, de modo que se oculte el lado adhesivo.
Se mantiene el porta con el dedo pulgar y el segundo dedo y la cinta con la uña.

66 Se presiona la superficie adhesiva sobre el lado derecho y el izquierdo de los pliegues perianales, pero sin insertar el porta en el recto.

67 Se vuelve a colocar la cinta sobre el porta (este porta se puede llevar al laboratorio o remitir al correo) Se desliza hacia atrás la cinta sobre el porta y se deja una pequeña porción pegada. Se añade una gota de tolueno y se vuelve a colocar la cinta adhesiva en el porta. (El tolueno decolora cualquier cosa, excepto los huevos y adultos en caso de estar presentes.

68 Se alisa la cinta con un trozo de gasa, que debe ser desinfectada y eliminada. Se efectúa un examen en busca de huevos y hembras adultas con un objetivo de bajo aumento.

69 Nota: recuérdese que los huevos de oxiuros son infecciosos, por lo que las muestras deben tratarse con cuidado para evitar infecciones.

70 REACCIONES DEL COLORANTE TRICROMICO
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71 En las reacciones del colorante tricromico los organismos, especialmente los trofozoitos de las muestras blandas o liquidas , se colorean a menudo mejor que los que provienen de muestras formes. El citoplasma de los quistes fijados y bien teñidos y de los trofozoitos es azul verdoso con matiz purpúreo.

72 Preparación de las soluciones
Solución nº 1: fijador de Shaudinn. *Alcohol etílico al 95%, 1 parte. *Cloruro de mercurio acuoso saturado, 2 partes. Solución nº 2: Fijador de PVA: * Se hace añadiendo 5gr de alcohol polivinilico en polvo(PVA), a 100 ml de fijador de Shaudinn modificado. * Se calienta a 75ºC, disolviendo hasta que la solución se aclare y se enfría a temperatura ambiente.

73 Solución nº 3: alcohol yodado.
*Añadase suficiente yodo en cristal a alcohol al 70% hasta conseguir una solución oscura concentrada. *Para su utilización se diluye algo de la solución anterior en alcohol al 70% hasta obtener una solución de color té oscuro. Solución nº 4: Colorante tricrómico. *Materiales: Cromótropo 2R: 0,6g. Verde claro SF: 0,15g. Ácido fosfotungstico: 0,7g. Ácido acético (glacial): 1ml Agua destilada: 100 ml.

74 *Colóquense los colorantes secos en un frasco limpio y seco.
*Añádase el ácido glacial, agítese y humedézcase todo el polvo colorante. *Se deja reposar la mezcla durante 30 min. Se añade el agua destilada y se agita fuertemente hasta mezclar por completo. *La tinción es púrpura y se puede encontrar preparado en distintas firmas comerciales. Solución nº 5: Alcohol acidificado. *Acido acético: 0,45 ml. *Alcohol etílico al 90%: 99,55 ml.

75 METODOS DE INMUNODIAGNOSTICO
Tecnicas de inmunoprecipitación e inmunodifusión. Inmunohistología Citómetro de flujo Técnica de ELISA Westernblot Radioinmunoanálisis Fijación del complemento Neutralización e inhibición de la hemaglutinación Aglutinación con látex Serología Menú

76 Las técnicas inmunológicas se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antígenos en muestras clínicas, así como para evaluar la respuesta de anticuerpos a la infección y la historia de un individuo de exposición a agentes infecciosos. La especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo y la sensibilidad de muchas de las técnicas inmunológicas hace que sean poderosas herramientas de laboratorio. En la mayoría de los casos, se puede utilizar la misma técnica para evaluar el antígeno y el anticuerpo.

77 TECNICAS DE PRECIPITACION E INMUNODIFUSION
Los complejos antígeno-anticuerpo específicos y las reacciones cruzadas se pueden distinguir por técnicas de inmunoprecipitación. Dentro de un intervalo limitado de concentración tanto de antígenos como de anticuerpos denominado zona de equivalencia, el anticuerpo une cruzada mente al antígeno a un complejo que es demasiado grande para permanecer en solución y, por tanto, precipita. Esta técnica se basa en la naturaleza multivalente de las moléculas de anticuerpos (p. Ej., la inmunoglobu­lina [Ig] G tiene dos zonas de unión al antígeno). Los complejos antígeno-anticuerpo son solubles con índices de concentración de antígeno con respecto a anticuerpo que están por encima y por debajo de la concentración de equivalencia.

78 INMUNODIFUSION RADIAL SIMPLE
La inmunodifusión radial simple se puede utilizar para detectar y cuantificar un antígeno. En esta técnica, el antígeno se coloca en un pocillo y se le deja difundir en un agár que contenga anticuerpo. Cuanto mayor es la concentración del antígeno, más lejos difunde hasta alcanzar la equi­valencia con el anticuerpo en el agar y precipita en forma de anillo alrededor del pocillo.

79 DIFUSION INMUNODOBLE DE OUCHTERLONY
La técnica de difusión inmunodoble de Ouchterlony se utiliza para determinar la relación de diferentes antígenos. En esta técnica se colocan soluciones de antígeno y anticuerpo en pocillos separados hechos en agar y se hace que difundan uno hacia el otro para establecer los gradientes de concentración de cada sustancia. Donde las concentraciones alcanzan la equivalencia se produce una línea visible de precipitación. Basándose en este patrón de líneas de precipitación, esta técnica también se puede utilizar para determinar si las muestras son idénticas, si comparten alguno, pero no todos, los epítopos (identidad parcial), o son diferentes. Esta técnica se usa para detectar anticuerpos de antígenos fúngi­cos (p. Ej., especies de Histoplasma, especies de Blastomyces, coccidioidomicosis ).

80 En otras técnicas de inmunodifusión, el antígeno se puede separar por electroforesis en agar y después hacer reaccionar con el anticuerpo (inmunoelectroforesis), se puede transferir por medio de electroforesis a agar que contiene anticuerpos (electroforesis «en cohete»), o el antígeno y el anticuerpo se pueden colocar en pocillos separados y dejar que se desplacen electroforéticamente el uno hacia el otro (contrainmunoelectroforesis).

81 Análisis de antígenos y anticuerpos por inmunoprecipitación
Análisis de antígenos y anticuerpos por inmunoprecipitación. La precipitación de la proteína se produce en el punto de equivalencia, en el cual el anticuerpo multivalente forma grandes complejos con el antígeno. A, difusión inmunodoble de Ouchterlony el antígeno y el anticuerpo difunden desde pocillos, se encuentran y forman una línea de precipitación. Si se colocan antígenos idénticos en pocillos adyacentes, la concentración de antígenos entre ellos se duplica, y no se produce precipitación en esta región. Si se utilizan diferentes antígenos, se producen dos líneas diferentes de precipitación. Si una muestra comparte antígeno (1/2) pero no es idéntico, se producirá una única línea para la totalidad del antígeno. B, contrain­munoelectroforesis. Esta técnica es similar al método de Ouchter­lony, pero el movimiento del antígeno es facilitado por electroforesis. e, inmunodifusión radial simple. Esta técnica implica la difusión del antígeno en un gel que contiene anticuerpos. Los anillos de precipitación indican un reacción inmune y el área del anillo es proporcional a la concentración del antígeno. D, electroforesis «en cohete». Los antí­genos se separan por electroforesis en un gel de agar que contiene anticuerpos. La longitud del «cohete» indica la concentración del antígeno. E. inmunoelectroforesis. Se coloca el antígeno en un pocillo y se separa por electroforesis. Después se coloca anticuerpo en un surco y se forman líneas de precipitación a medida que el antígeno y el anticuerpo difunden el uno hacia el otro.

82 INMUNOANALISIS PARA ANTIGENOS ASOCIADOS A CELULAS (INMUNOHISTOLOGIA)
Los antígenos existentes en la superficie o en el interior de la célula se pueden detectar por inmunofluorescencia o enzimoinmunoanálisis (EIA). En la inmunofluorescencia directa una molécula fluorescente se une de forma covalente al anticuerpo (p. Ej., anticuerpo antivírico de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína). En la inmunofluorescencia indirecta se utiliza un segundo anticuerpo fluorescente específico para el anticuerpo primario (p. Ej., anticuerpo de cabra anticonejo marcado con isotiocianato de fluoresceína) para detectar el anticuerpo antivírico primario y localizar el antígeno. En el ElA, una enzima como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina se conjugan con el anticuerpo y convierten un sus trato en un cromóforo para marcar el antígeno. Estas técnicas son útiles para el análisis de muestras de biopsias tisulares, células sanguíneas y células de cultivo tisular.

83 Inmunofluorescencia e inmoanálisis enzimático para la localización de antígenos en células. El antígeno se puede detectar por análisis directo con anticuerpos víricos modificados de forma covalente con una enzima o una sonda fluorescente, o por análisis indirecto utilizando un anticuerpo antivírico y una antiinmunoglobulina modificada químicamente. La enzima convierte el sustrato en un precipitado, cromóforo o luz.

84 CITOMETRO DE FLUJO El citómetro de flujo se puede utilizar para analizar la inmunofluorescencia de células en suspensión y es especialmente útil para identificar y cuantificar linfocitos (inmunofenotipificación). En el citómetro de flujo se utiliza un láser para excitar el anticuerpo fluorescente unido a la célula y determinar el tamaño de la célula por medio de mediciones de dispersión de luz. Las células fluyen a través del láser a velocidades de más de células por segundo y el análisis se efectúa electrónicamente. El seleccionador de células activadas por fluorescencia (SCAF) es un citómetro de flujo que también puede aislar subpoblaciones específicas de células para su crecimiento en cultivo tisular basándose en su tamaño e inmunofluorescencia.

85 Los datos obtenidos de un citómetro de flujo usualmente se presentan en forma de histograma con la intensidad de fluorescencia en el eje xy el número de células en el eje y, o en forma de un diagrama de puntos en el cual se compara más de un parámetro para cada célula. El citómetro de flujo puede efectuar un análisis diferencial de leucocitos y comparar poblaciones de células T CD4 y CD8 simultáneamente. La citometría de flujo también es útil para analizar el crecimiento celular después de marcar con fluorescencia el ADN u otras aplicaciones de la fluorescencia.

86 Citometría de flujo A, el citómetro de flujo evalúa parámetros de las células individuales a medida que las células fluyen a través de un rayo láser a velocidades de más de por segundo. El tamaño y granularidad de las células se determinan por la dispersión de la luz (DU, y la expresión del antígeno se evalúa porinmunofluorescencia (F), utilizando anticuerpos marcados con diferentes sondas fluorescentes. De 8 a O, análisis de células T de un paciente normal. 8, el análisis de dispersión de la luz se utilizó para definir los linfocitos (Li), los monocitos (Mo) y polimorfonucleares (PMN)[, los linfocitos se analizaron para determinar la expresión de CD3 para identificar células T (presentadas en un histograma). O, se identificaron células T CD4 y CD8. Cada punto representa una célula T. (Datos comprobados por el doctor Tom Alexander, Akron, Ohio.)

87 INMUNOANALISIS PARA ANTICUERPOS Y ANTIGENOS SOLOUBLES
ENZIMOINMUNOANALISIS DE ABSORCION (ELISA) La técnica de enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA) utiliza un antígeno inmovilizado en una superficie, una bolita o un filtro de plástico para capturar y separar un anticuerpo específico de otros anticuerpos presentes en el suero de un paciente. El anticuerpo del paciente así fijado se detecta posteriormente por medio de un anticuerpo antihumano con una enzima unida de forma covalente (p. Ej., peroxidasa de rábano pi­cante, fosfatasa alcalina, galactosidasa). Se cuantifica por espectrofotometría según la intensidad del color producido en respuesta a la conversión de un sustrato adecuado por la enzima. Se puede determinar la concentración real del anticuerpo por comparación con soluciones están dar de anticuerpos. Las diversas variaciones de los ELISA difieren en la forma en la que capturan o detectan los anticuerpos o los antígenos.

88 Los ELISA también se pueden utilizar para cuantificar un antígeno soluble en la muestra de un paciente. En estos análisis el antígeno soluble es capturado y concentrado por un anticuerpo inmovilizado y después se detecta con un anticuerpo diferente marcado con una enzima. Un ejemplo de un ELISA que se utiliza comúnmente es la prueba doméstica de embarazo con la hormona gonadotropina coriónica humana.

89 Enzimoinmunoanálisis para la cuantificación de anticuerpos o antígenos
Enzimoinmunoanálisis para la cuantificación de anticuerpos o antígenos. A, detección de anticuerpos. 1, un antígeno vírico obtenido de células infectadas, viriones o ingeniería genética se fija a la superficie. 2, se agrega suero del paciente y se deja que se una al antígeno. Los anticuerpos no fijados se eliminan con el lavado. 3, se agrega anticuerpo antihumano conjugado con una enzima y se elimina con el lavado el anticuerpo no fijado. 4, se agrega un sustrato y 5, éste se convierte en cromóforo, precipitado o luz. B, captura y detección del antígeno. 1, se fija a la superficie un anticuerpo antivírico. 2, se agrega una muestra que contiene antígeno y se elimina con el lavado el antígeno no fijado. 3, se agrega un segundo anticuerpo antivírico para detectar el antígeno capturado. 4, un antígeno humano conjugado con una enzima se agrega, se lava y se continúa con, 5, un sustrato que es, 6, convertido en cromóforo, precipitado o luz.

90 WESTERN BLOT El análisis Westem blot es una variante de un ELISA. En esta técnica, proteínas víricas separadas por electroforesis según su peso molecular o su carga se transfieren (impregnan blotD a un papel de filtro (p. Ej., nitrocelulosa, nylon)Cuando se exponen al suero del paciente, las proteínas inmovilizadas capturan los anticuerpos antivirus específicos y se visualizan con anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. Esta técnica muestralas proteínas reconocidas por el suero del paciente. El análisis Western blot se utiliza para confirmar los resultados del ELISA 1 en pacientes con sospecha de estar infectados por virus de la in­munodeficiencia humana (VIH).

91 Western blot. Las proteínas se separan por electroforesis con dodecil sulfato sódico en gel de poliacrilamida (DSSGEPA) se electrotransfieren a un papel de nitrocelulosa (NC) y se incuban con antisuero específico del antígeno o del paciente W Ably después con suero antihumano conjugado con enzimas (2° Ab) La 1 conversión enzimática del sustrata identifica al antígena.

92 RADIOINMUNOANALISIS En el radioinmunoanálisis (RIA) se utilizan anticuerpos o antígenos marcados radiactivamente (con yodo 125) para cuan­tificar complejos antígeno-anticuerpo. El RIA se puede efectuar como un análisis de captura, como se describió anteriormente para el ELISA, o como un análisis de competencia. En un análisis de competencia los anticuerpos en el suero de un paciente se cuantifican según su capacidad de competir con un anticuerpo marcado radiactivamente en el laboratorio y reemplazado en los complejos antígeno-anticuerpo. Los complejos antígeno-anti­cuerpo se precipitan y se separan de los anticuerpos libres y se mide la radiactividad de las dos fracciones. La cantidad de anti­cuerpos del paciente se cuantifica posteriormente a partir de curvas están dar preparadas utilizando cantidades conocidas del anticuerpo competidor. El radioalergoanálisis es una variante del RIA de captura en el cual se usan anti IgE marcados radiacti­vamente para detectar respuestas específicas a un alergeno.

93 FIJACION DEL COMPLEMENTO
La fijación del complemento es una prueba serológica estándar pero técnicamente difícil. En esta prueba la muestra de suero del paciente se hace reaccionar con antígeno del laboratorio y complemento extra. Los complejos antígeno-anti­cuerpo se unen, activan y fijan (consumen) el complemento. Des­pués se analiza el complemento residual por medio de la lisis de hematíes recubiertos con anticuerpos. Los anticuerpos medidos con este sistema generalmente se desarrollan algo más tarde en el curso de una enfermedad que los medidos con otras técnicas.

94 NEUTRALIZACION E INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION
En los análisis de inhibición de anticuerpos se utiliza la especificidad de un anticuerpo para evitar una infección (neutralización) y otra actividad (inhibición de la Hemaglutinación) para identificar la cepa del agente infectante, usualmente un virus, o para cuantificar las respuestas de anticuerpos a una cepa específica de un virus. Por ejemplo, la inhibición de la hemoaglutinación se utiliza para distinguir diferentes cepas de virus influenza A.

95 AGLUTINACION CON LATEX
La aglutinación con látex es una prueba rápida y técnica­mente simple para detectar un anticuerpo o un antígeno soluble. Los anticuerpos específicos de un virus hacen que las partículas de látex recubiertas con antígenos víricos se agrupen. Inversamente, las partículas de látex recubiertas de anticuerpos se utilizan para detectar antígenos víricos solubles. En la hemaglutinación pasiva se utilizan como indicadores eritrocitos modificados antigénicamente en lugar de partículas de látex.

96 SEROLOGIA La respuesta inmune humoral de un paciente proporciona una historia de sus infecciones. La serología se puede utilizar para identificar el agente infectante, evaluar el curso de una infección o determinar la naturaleza de la infección: si es una infección primaria o una reinfección, o si es aguda o crónica. Los datos serológicos de una infección se obtienen del tipo y título de los anticuerpos y de la identidad de los objetivos antigénicos. Las pruebas serológicas se utilizan para identificar virus y otros agentes difíciles de aislar y cultivar en el laboratorio o que causan enfermedades con cursos más lentos.La concentración relativa de anticuerpos se considera como un título. Un título es el inverso de la mayor dilución, o menor concentración (p. Ej., dilución de 1 :64 = título de 64) del suero de un paciente que conserva actividad en los análisis antes descritos. Las IgG, IgA, IgE o IgM específicas de un paciente se pueden evaluar separadamente por medio del uso de un segundo anticuerpo antihumano marcado que sea específico para el iso tipo de anticuerpo por inmunofluorescencia indirecta, aglutinación con látex, ELISA o RIA.

97 La serología se utiliza para determinar el estado de evolución de una infección, estableciendo si se ha producido seroconversión. La seroconversión ocurre cuando se producen anticuerpos en respuesta a una infección primaria. El anticuerpo IgM específico, encontrado durante las primeras dos o tres semanas de una infección primaria, generalmente indica una infección primaria reciente. La seroconversión viene indicada por el hallazgo de un aumento de almeno 4 veces en el título de anticuerpos entre el suero obtenido en la fase aguda de la enfermedad y el obtenido dos o tres semanas más tarde, durante la fase de convalecencia. Una posterior reinfección o recurrencia causa una respuesta anamnéstica (secundaria o amplificada). Los títulos de anticuerpos pueden mantenerse altos, sin embargo, en pacientes cuya infección recurre con frecuencia (p. Ej., herpes virus).

98 La serología también se puede utilizar para determinar el estadio de una infección más lenta o crónica (p.ej., hepatitis B, mononucleosis infecciosa causada por el virus de Epstein Barr) basándose en la presencia de anticuerpos para antígenos específicos. Los primeros anticuerpos que se detectan son los dirigidos contra los antígenos más accesibles al sistema inmune (p.ej., en el virión, en la superficie de las células infectadas, secretados). Más tarde, en el curso de la infección, cuando las células han sido lisadas por el virus infectante o por la respuesta inmune celular, se detectan anticuerpos dirigidos contra las proteínas intracelulares.

99 GRACIAS