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ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas Mayela López M. Fernanda Rodríguez Alexander Romero.

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1 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas Mayela López M. Fernanda Rodríguez Alexander Romero

2 ELISA HISTORIA 1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos inmunoenzimáticos que fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van Wemeny y Schuurs. El uso de material radiactivo ha limitado el uso del radioinmunoensayo, y a la ves a popularizadp el empleo del inmunoensayo enzimático (EIA), del que hay dos técnicas principales: El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas El ensayo inmunológico multiplicado por enzimas.

3 ELISA La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura. Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos

4 ELISA Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: Competitivos No competitivos

5 ELISA ELISA COMPETITIVO: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

6 ELISA ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color

7 ELISA Dentro de los no competitivos tenemos: Los directos que detectan antígenos Los indirectos que detectan anticuerpos.

8 ELISA Pasos generales de un ELISA 1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el posillo. 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adición del sustrato 9. Unión del sustrato a la enzima 10. Desarrollo del color

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10 ELISA Competitiva (1)

11 ELISA Competitiva (2)

12 ELISA Competitiva (3)

13 ELISA Competitiva (4)

14 ELISA Competitiva (5)

15 ELISA Competitiva (6)

16 ELISA Competitiva (7)

17 ELISA Competitiva (1)

18 ELISA Competitiva (9)

19 ELISA Competitiva (10)

20 Ejemplos

21 Dengue Virus Es un virus de ARN de cadena simple con un diámetro de 50 nm. Pertenece a la familia de los Flaviviridae Se distinguen cuatro grupos serológicos: DEN- 1 DEN-2 DEN-3 DEN-4

22 DENGUE... La infección con un serotipo no produce inmunidad para los otros. El Aedes aegypti constituye el principal vector del dengue.

23 Dengue... Imágenes clínicas: Periodo de incubación de 1 a 2 semanas con escalofríos. Dolores de cabeza Dolores de miembros y músculos.

24 Dengue... Dengue hemorrágico: Petequias Fuertes hemorragias nasales Vómito de sangre Melena Hematuria La agravación de la enfermedad deriva en el Síndrome de Shock.

25 Utilización de la prueba El inmunoensayo se utiliza para la determinación cualitativa y semicualitativa de anticuerpos IgG específicos contra Dengue- Virus en suero o plasma humano.

26 Principio del Ensayo Las tiras de micropocillos (fase sólida) están recubiertas con antígenos específicos del Dengue- Virus. Los anticuerpos presentes en la muestra se unen a los antígenos inmobilizados en la placa.

27 Principio... El conjugado de anticuerpos IgG anti humano con peroxidasa del rábano, se une a los complejos antígeno anticuerpo en muestras positivas. Después de incubarse, los complejos muestran una coloración azul, al incubarlos con TMB.

28 Principio... Finalmente, se añade ácido sulfúrico para detener la reacción ( azul - amarillo); la densidad se mide con un lector de ELISA a 450 nm.

29 Procedimiento Repartición y Posición de las muestras. Se Gradúa la incubadora a 37+1 °C. Se pipetean 100 ul de controles y muestras en los pocillos respectivos. Se recubren las tiras con los autoadhesivos. Se incuba 1h + 5 min. Después de incubar, se retira el autoadhesivo y se realiza el lavado.

30 Procedimiento... Pipetea 100 ul del conjugado anti IgG. Se incuba 30 min a temperatura ambiente. Repetir el lavado. Se pipetea 100 ul de sustrato de TMB. Incuba 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Se añade la solución de parada Se mide la extinción de la solución con 450/620nm por 30 min.

31 ETI- LKM1 y ETI mitocondrial Permite la determiación cualitativa de autoanticuerpos dirigidos contra el citocromo P450 (LKM1) y las enzimas mitocondriales (M2A/M2C) en suero humano.

32 Principio del Ensayo Los pocillos de la microplaca se recubren con los antígenos. Al añadir las muestras,, el anticuerpo se une a los pocillos recubiertos. En estos se incub IgG conjugada con la enzima peroxidasa del rábano contra IgG humano. Se añada cromógeno y se lee con el espectrofotómetro.

33 ¡MUCHAS GRACIAS!


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