Servicio Medico Legal Santiago

Presentación del tema: "Servicio Medico Legal Santiago"— Transcripción de la presentación:

1 Servicio Medico Legal Santiago
INMUNOANALISIS Servicio Medico Legal Santiago Q. L. Ethel Guerrero R. Q. F. L. Víctor Vidal P.

2 Definición Técnicas que utilizan la reacción antígeno- anticuerpo para el análisis cualitativo y cuantitativo de diversas sustancias. En general se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar lo que nos interesa, el antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales

3 Producción de Anticuerpos
Requiere la inyección de varias dosis del antígeno o hapteno unido a molécula transportadora inmunógena de Peso Molecular elevado, a un animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a intervalos regulares, para posteriormente sacrificar el animal y obtener el antisuero.

4 Anticuerpos Policlonales
Purificación de anticuerpos Separar el suero

5 Anticuerpos Monoclonales
Se obtienen de manera similar, pero se extrae el bazo o ganglios linfáticos para obtener linfocitos B sensibilizados. Se incuban estos con células de mieloma de ratón deficitarias de la enzima HGPRT en presencia de PEG para producir la fusión celular y obtener el hibridoma

6 Cultivados en medio apropiado, por dos semanas, solo crecen los hibridomas, que producen diferentes tipos de Ac. específicos contra el antígeno. Por dilución se aislan los diferentes hibridomas, obteniéndose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal más adecuado.

7 Anticuerpos Monoclonales
Células de Mieloma Linfocitos sensibilizados Fusión Hibridomas

8 Anticuerpos Monoclonales
Cultivo de células individuales en pequeño volumen - + - + Producción de Ac Crecimiento continuo - + + -

9 Anticuerpos Monoclonales
Cultivo en grandes volúmenes Recuperar y purificar el AcMo secretado

10 Anticuerpos Monoclonales
Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un único lugar antigénico. Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. Desventajas: Mayor costo

11 Ejemplos Cualitativo o de identificación: Inmunoblot
Cuantitativo: ELISA

12 Inmunoanálisis con reactivos marcados
Dentro de estos inmunoanálisis tenemos: radioinmunoanálisis enzimoinmunoanálisis fluoroinmunoanálisis luminoinmunoanálisis i

13 Inmunoanálisis con reactivos marcados
homogéneos y heterogéneos diseño competitivo o no competitivo i

14 Según el diseño del ensayo
competitivos (de reactivo limitado) no competitivos (de reactivo en exceso)

15 Competitivos Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno o anticuerpo. Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antígeno. El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresión correspondiente.

16 Competitivo- Captura de anticuerpos
Ac marcado + E Ag muestra Sustrato Señal Ag muestra + Ac marcado Señal [Ag]

17 Competitivo- Captura de Antígeno
Señal Antígeno marcado [Ag] Muestra Señal Lavado

18 Métodos no competitivos o inmunométricos
El antígeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos. Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase sólida, revelando con anticuerpo marcado. La concentración de antígeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.

19 No competitivo- “sandwich” de anticuerpos
Exceso de anticuerpo marcado eliminado por lavado bloqueante + E Ag E Sustra-to Señal Curva standard Señal [Ag]

20 Según el diseño del ensayo
homogéneos heterogéneos

21 Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de fármacos
Heterogéneos: Los más utilizados. Diversos formatos : micro placas, partículas magnéticas, Membranas de nitrocelulosa, Implican un paso de separación del antígeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separación. Homogéneos Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de fármacos Sin pasos de separación, no se requiere la separación del antígeno unido del no unido. Ejemplos Emit Cedia

22 Heterogéneos Homogéneos Ventajas Desventajas Ventajas Desventajas
Menos interferencias, más específicos y sensibles Instrumentación menos costosa Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el límite de detección. Más versátiles en cuanto a tipo de analito Desventajas Más difíciles de automatizar Mayor tiempo de análisis Ventajas Más precisos Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial Desventajas Son más costosos en reactivos En general sólo sirven para fármacos

23 Heterogéneos Algunos métodos de separación:
Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol en frío o PEG. Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, partículas magnéticas) Centrifugación

24 Homogéneos Características
La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los EIA homogéneos se realiza por cambios en la señal proveniente de la marca sin hacer separación física de las formas libre y unida. El cambio de señal depende de la inhibición , activación o cambios conformacionales en la enzima. Monitoreo terapéutico de fármacos (digoxina) detección de drogas de abuso.

25 Homogéneos Ac Ag Ag Enzima Sustrato Ag

26 Homogéneos Detección y Cuantificación: S Ag Enzima activa
Enzima inactiva Detección y Cuantificación: Las medidas se pueden hacer con: - un simple espectrofotómetro o con - un analizador automático de química clínica.

27 Inmunoanálisis con reactivos marcados
Con compuestos radiactivos: RIA inmunoanálisis heterogéneo y competitivo IRMA inmunoanálisis heterogéneo no competitivo i

28 Inmunoanálisis con reactivos marcados
ENZIMOINMUNOANALISIS: Las más utilizadas son: peroxidasa fosfatasa alcalina Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa B- galactosidasa Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por técnicas simples tienen varios sustratos

29 ENZIMOINMUNOANALISIS
Enzimoinmunoanálisis homogéneos: EMIT CEDIA Enzimoinmunoanálisis heterogéneos: ELISA

30 FLUOROINMUNOANALISIS
Fluoroinmunoanálisis homogéneos: FPIA (de polarización de fluorescencia) SLFIA (sustrato marcado) FETI (transferencia de la energía de fluorescencia) Fluoroinmunoanálisis heterogéneos: DELFIA (disociación aumentada por lantánidos)

31 Inmunoensayos de Fluorescencia
Fluoróforos Fluoresceína

32 Quimioluminiscencia Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas y consiste en: una reacción química con un muy alto rendimiento energético produce una molécula potencialmente fluorescente. (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia) Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible. Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los métodos isotópicos y en otros enzimáticos.

33 Técnica analítica Quimioluminiscente
Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la detección. Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas