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Técnicas para Evaluar Inmunidad Viral Inmunología Aplicada 1065 Formación de profesores 2005 Carolina Hernández Supervisado por MD Lastra.

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1 Técnicas para Evaluar Inmunidad Viral Inmunología Aplicada 1065 Formación de profesores 2005 Carolina Hernández Supervisado por MD Lastra

2 Radioinmunoensayo (RIA) Técnica muy sensible basada en la competencia de unión al anticuerpo específico entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. A mayor antígeno a cuantificar, menor será el antígeno marcado unido al anticuerpo y viceversa.

3 Enzimoinmunoanálisis (EIA) Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general, un pocillo de una microplaca o una esfera de plástico. El antigeno presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado. El Ag se detecta con otro anticuerpo específico conjugado a una enzima, se adiciona un sustrato para la enzima y se mide la intensidad de color.

4 Enzimoinmunoanálisis Indirecto (EIA) Se han aplicado de manera amplia en el diagnóstico de anticuerpos virales. Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (policubetas), se agregan los sueros en estudio, se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una Ig antiespecie conjugada con una enzima seguida de un sustrato apropiado para esta.

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6 ELISA Permite identificar inmunocomplejos por medio de enzimas unidas al antígeno o anticuerpo, estando uno de ellos adsorbido a un soporte sólido (placa de poliestireno). La reacción antígeno-anticuerpo se detecta mediante la utilización de un marcador que es una enzima conjugada químicamente al antígeno o anticuerpo (peroxidasa, fosfatasa), se añade un sustrato al cuál la enzima convierte de incoloro a un producto coloreado.

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8 ELISPOT Prueba diseñada originalmente para la detección de células B secretoras de anticuerpos antígeno específicos. Se ha adaptado para la detección de células secretoras de citocinas específicas u otros antígenos. Incorpora el ensayo inmunoenzimático en fase sólida ELISA. Es un método sensible y selectivo para el estudio de citocinas, no requiere estimulación previa para reflejar la situación in vivo.

9 ELISPOT Se puede utilizar para cuantificar y monitorear respuesta de células T con frecuencias del orden de 1 en 100,00, así como células que secreten menos de 100 moléculas de citocina por segundo. El IFN-γ secretado por las células en cultivo, es capturado en las inmediaciones de la células por un anticuerpo específico anti- IFN-γ adsorbido en el fondo del pozo.

10 ELISPOT Las células se retiran mediante lavados sucesivos y se adiciona un segundo anticuerpo específico anti-IFN-γ marcado con una enzima, el cuál va a adherirse al interferón inmovilizado por el primer anticuerpo, al adicionar el sustrato de la enzima se forma un producto colorido insoluble que permite ver el sitio en donde se encontraba la célula secretora de IFN-γ como una mancha de color.

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12 Inmunofluorescencia Es una técnica histoquímica o citoquímica, útil para detectar y localizar antígenos en células o tejidos. Se utiliza un anticuerpo específico conjugado con un compuesto fluorescente dando como resultado un marcador sensible contra el antígeno. Inmunofluorescencia directa (ID). El anticuerpo conjugado se añade directamente a la sección de tejido o suspensión de células viables.

13 Inmunofluorescencia Indirecta Se basa en la unión de anticuerpos antivirales a los antigenos virales expresados en la superficie y el citoplasma de células infectadas (fijadas en un portaobjetos). Útil para la determinación de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se incuba el suero del paciente con las células infectadas y se agrega un anticuerpo anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

14 Inmunofluorescencia Puede usarse para detectar el virus de la influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros

15 Virus de la influenza La presencia de anticuerpos en el citoplasma y superficie de las células infectadas

16 Aglutinación en látex La aglutinación de las partículas de látex recubiertas por un Ag específico permite la detección de Ac libres específicos para el Ag Se basa en las interacciones Ag-Ac, donde la cantidad y especificidad de la reacción se evalúa por los cambios físicos inducidos tras la unión del anticuerpo específico con su antígeno correspondiente para formar inmunocomplejos.

17 Hemaglutinación Ciertos virus (influenza, parainfluenza y togavirus) producen antígenos que logran acoplarse de manera espontánea a los eritrocitos y forman reactivos estables para la detección de anticuerpos. Esta reacción puede inhibirse usando un anticuerpo específico antiviral. De esta manera la hemaglutinación puede usarse para cuantificar el virus y el título de anticuerpos contra el virus hemaglutinante.

18 Western Blot (WB) Con el uso combinado de electroforésis y ELISA puede determinarse la respuesta a una diversidad de proteínas específicas a patógenos. Este procedimiento proporciona un medio específico para identificar reactividad de anticuerpos.

19 Western Blot (WB) Se basa en la separación de los antígenos virales mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE (lo cual proporciona una carga negativa a la proteínas). Las proteínas virales son sometidas a una electroforesis en geles de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente se separan con base a su peso molecular (las más grandes permanecen en la parte superior del gel y las menores migran hacia la base).

20 Western Blot (WB) Las proteínas se transfieren a un soporte sólido (papel de nitrocelulosa, nylon), lo cual da una copia exacta del patrón del gel en la matriz. La identificación de las proteínas a estudiar se realiza usando un ELISA indirecto. Las reacciones se leen como positivas cuando una línea de precipitación o color se forma en el peso molecular correcto para una proteína particular.

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