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ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA Servei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol.

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Presentación del tema: "ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA Servei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol."— Transcripción de la presentación:

1 ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA Servei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol

2 Introducción 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% en paises en vías de desarrollo 2 millones de personas mueren anualmente 1/3 de la población mundial está infectada

3 Relación huésped-parásito Llegada de M.tuberculosis a los alveolos pulmonares donde es fagocitado por los macrófagos alveolares. El bacilo es capaz de multiplicarse en el fagosoma y destruir posteriormente al macrófago. Los macrófagos segregan citocinas que atraen neutrófilos, linfocitos y macrófagos para que fagociten bacilos extracelulares, así como para generar un foco inflamatorio.

4 Relación huésped-parásito Los linfocitos T CD4 específicos se transforman en linfocitos Th1 bajo la influencia de IL-12 secretada por los macrófagos. Th1 segrega TNF- que permiten la llegada de más macrófagos, e IFN- que activa a los que están infectados.

5 Relación huésped-parásito Los linfocitos T también segregan IFN- para activar macrófagos e IL-12 para que proliferen Th1. El macrófago sintetiza IL-12 que estimula a las cél NK que también sintetizan IFN-.

6 Relación huésped-parásito El IFN- es la citocina efectora clave en el control de la infección micobacteriana mediante la activación de los macrófagos. IFN- es la citocina esencial en el desarrollo de la inmunidad protectora contra M. tuberculosis. En combinación con TNF- consigue unos efectos bactericidas del 90% de la concentración bacilar en los tejidos.

7 Relación huésped-parásito Sin embargo, mientras se desencadena esta RI innata, los bacilos se van diseminando hacia los nódulos linfáticos regionales y los vasos sanguíneos. La RI específica consta no tan sólo de la proliferación de T CD4, sino también del estímulo de una sensibilidad retardada tipo IV (que se pone de manifiesto mediante TST).

8 Relación huésped-parásito En un 5% puede originarse una enfermedad primaria. Pero, en un 95% de los casos suele resolverse el complejo primario, quedando M. tuberculosis en estado latente. En un 5% de estos casos, puede originarse una enfermedad posprimaria de reactivación durante toda la vida del huésped.

9 Objetivos propuestos para controlar la tuberculosis Pautas antibióticas más cortas y con menos efectos secundarios Una vacuna eficaz y accesible a toda la población Métodos diagnósticos rápidos, sensibles y específicos

10 Métodos diagnósticos Un diagnóstico rápido y fiable de la tuberculosis constituye un elemento fundamental en las medidas de control de la enfermedad. Los métodos microbiológicos de referencia en el diagnóstico de la TB continúan siendo el examen microscópico, cultivo y aislamiento de M. tuberculosis y la detección de sus ácidos nucleicos.

11 Métodos diagnósticos Se requiere de métodos diagnósticos para la detección de pacientes con el bacilo latente. Las personas infectadas con el microorganismo latente representan un peligro potencial de nuevos casos de TB. La única manera de controlar la TB es interrumpir la cadena de infección.

12 Tuberculina La tuberculina (TST) es una prueba de intradermoreacción que permite la detección de individuos infectados: Evitando el paso de infección a enfermedad. Rompiendo la cadena de transmisión.

13 Tuberculina Evalúa la hipersensibilidad retardada que determinados compuestos antigénicos del bacilo provocan en el infectado. La tuberculina se obtiene del filtrado del cultivo de M. tuberculosis esterilizado y concentrado. Actualmente está constituido por un derivado proteico purificado (PPD).

14 Respuesta inflamatoria. Infiltración perivascular linfomonocitaria. Induración visible y palpable. Liberación citocinas Célula T CPA Tuberculina

15 Inconvenientes Tuberculina Algunos de los constituyentes proteicos del PPD son compartidos por micobacterias ambientales y por el bacilo vacunal (BCG). Falta de respuesta en pacientes con alteraciones de la inmunidad celular. Errores en la administración y subjetividad en la interpretación de los resultados. Visita de lectura. Conmoción social.

16 IFN- test Nueva estrategia en el diagnóstico de la infección latente Basándose en el fundamento de la tuberculina se han diseñado nuevas estrategias in vitro para evidenciar la sensibilización de las células T. Se han empleado diferentes antígenos micobacterianos para la estimulación de las células. Revelar la sensibilización mediante detección de IFN-.

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18 Fundamento de la tecnología

19 Determinacíon IFN- Liberación IFN- Célula T CPA Estimulación antigénica

20 Principales antígenos evaluados PPD ESAT-6 y CFP10

21 Resultados empleando PPD como antígeno 67 ADVP. HIV pos y neg. Mayor concordancia TST y IFN- test en HIV positivos 952 voluntarios 455 individuos. G1: Inmigrantes G2: Personal Sanitario G3: TBC activa No diferencias en extrapulmonar vs pulmonar ni si baciloscopia positiva Personal sanitario. 20 TST +, 20 TST adultos. 390 TST + / 349 IFN- test + TST + / IFN- test -. 7x en vacunados 253 voluntarios Etiopia. 35% concordancia TST y IFN- test 175 Baltimore. 68 % concordancia TST y IFN- test

22 ESAT-6 y CFP-10 Early Secretory Antigen Target-6. Culture Filtrate Protein 10. Proteínas secretadas por M.tuberculosis complex. No está presente en la mayoría de micobacterias ambientales. No está presente en el bacilo vacunal (BCG).

23 Especificidad de ESAT-6 y CFP-10 Micobacterias ambientales Antígenos ESATCFP M abcessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonii-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M oenavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Tuberculosis complex Antígenos ESATCFP M tuberculosis++ M africanum++ M bovis++ BCG substrain gothenburg-- moreau-- tice-- tokyo-- danish-- glaxo-- montreal-- pasteur--

24 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 8 péptidos sintéticos de ESAT-6. Células mononucleares. ELISA. Dinamarca. Etiopia. TB: 11/34 (32,5%) Contactos con TB: 14/30 (466%) ESAT 6 recombinante. Células mononucleares. ELISA Hª consistente con LTBI en presencia de inmunidad 8 péptidos sínteticos de ESAT-6. Células mononucleares. ELISPOT. En supuestos TST neg: 3 pos/11 (338%)

25 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Pathan A et al J. Immunol Control no expuesto: 0% Convivientes expuestos: 85% TBC pulmonar: 88-92% La frecuencia de linfocitos T antígeno específico (ESAT-6) disminuyen con el tratamiento.

26 Infección Enfermedad TIEMPO RESPUESTA IFN- Carga Micobacteriana Efecto tratamiento en IFN- TST Rx

27 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Doherty T et al. J. Clin. Microbiol Convivientes expuestos (24). Seguimiento de 2 años. Desarrollaron TBC (7): TST pos (7), IFN- test pos (6) No desarrollaron TBC (17): TST pos (14), IFN- test pos (3) Indicador de riesgo de progresión a TBC.

28 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Arend S. et al. J. Infect. Dis. 2002

29 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Cardoso F.L. et al. Infect. Immun Resultados positivos del IFN- test: 60% TBC 50% Leprosos 60% Pacientes control 59% Vacunados (todos TST pos) 36% de similitud de la ESAT-6 de M.tuberculosis y M.leprae.

30 Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Ewer K et al. Lancet ESAT-6 recombinante y 12 pools de proteínas derivadas del ESAT-6 y CFP-10 89% de concordancia con la tuberculina. Correlaciona mejor que la tuberculina con exposición a M.tuberculosis en términos de tiempo (p=0.007) y proximidad (p=0.03). No correlación con vacunados con BCG (p=0.44).

31 Estudios comparativos PPD y ESAT-6 Vacuna a 60 estudiantes de Medicina. ESAT-6: Sangre total y ELISA 19 Vacunados: 9 + por PPD y 2 + por ESAT-6

32 Métodos in vitro estandarizados QuantiFERON-TB Gold ELISPOT

33 QuantiFERON-TB Gold El QuantiFERON- TB Gold (QFN) es un método basado en la estimulación de sangre total mediante ESAT-6 y CFP-10. Determinación de la síntesis de IFN- por las células T sensibilizadas mediante técnica de ELISA.

34 Extracción Incubar overnigth a 37 o C Los individuos infectados por TB responden secretando IFN- Fase 1: Estimulación linfocitos T ESAT-6CFP-10Mitogen Control Transferir sangre total sin diluir en los pocillos de una placa de cultivo y añadir antígenos. Tiempo límite para el procesamiento de la muestra: 12 horas Nil Control

35 Recoger el plasma del sobrenadante de las células e incubar 120 min en un ELISA tipo Sandwich Lavar, añadir Substrato, incubar 30 min y parar la reacción TMBCOLOR Fase 2: Determinación de IFN- Determinación niveles de IFN- Determinación niveles de IFN- IFN- IU/ml OD 450nm Curva Standard

36 ELISPOT Método basado en la estimulación de células monocíticas extraidas de sangre periférica mediante la proteína ESAT-6. Determinación de la síntesis de IFN- por las células sensibilizadas mediante técnica de ELISPOT.

37 ELISPOT Anticuerpos específicos fijados a membrana Medio de cultivo con células y el antígeno

38 ELISPOT horas a 37ºC. CO 2

39 ELISPOT - Anticuerpo secundario. 25h. TA. Humedad. - Streptavidina-HRP. 2h. TA

40 ELISPOT - Añadir sustrato cromogénico. - Incubar a TA.

41 Lectura de los resultados Se considera positivo si el pocillo de la muestra contiene una media de 5 spot- forming cells más que el control negativo.

42 CDC Guidelines para la utilización del QFN El test de la tuberculina y el QFN no detectan los mismo componentes de la respuesta inmune. Debe ser utilizado en laboratorios con experiencia en el test.

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44 Recomendaciones CDC Guidelines para la utilización del QFN Utilización Personas con elevado riesgo de infección latente. Personas con bajo riesgo de infección tuberculosa y sin factores predisponentes.

45 Recomendaciones CDC Guidelines para la utilización del QFN Confirmación del resultado de QFN Bajo riesgo: QFN pos requiere confirmación por tuberculina. Si TST neg no quimioprofilaxis. Alto riesgo: QFN pos requiere confirmación por tuberculina. Si TST neg, quimioprofilaxis a juicio clínico. QFN neg no requiere confirmación.

46 Contraindicaciones CDC Guidelines para la utilización del QFN En personas con sospecha de TB activa. En estudio de contactos de tuberculosos. Niños y jóvenes < 17 a., embarazadas, o personas con patologías subyacentes que aumenten el riesgo de progresión a TB. No test confirmatorio de la tuberculina.

47 Ventajas de esta tecnología No subjetividad en la interpretación. Posibilidad de repetir determinaciones. Resultados rápidos. Se elimina la visita de lectura. Controles de falta de respuesta inmune. De fácil estandarización. No interferencia con la vacuna BCG.

48 Antígenos lipídicos y glicolipídicos Ulrichs T. et al Se ha descrito un subtipo de cél T dependientes de moléculas CD1. Estas moléculas presentan antigenos lípidos y glicolipídicos. Las T que reconocen estos antígenos también producen IFN-. Mayor respuesta frente a estos antígenos en individuos TST pos que en TST neg. Mayor respuesta en tuberculosos a las dos semanas de tratamiento que en el momento del diagnóstico.

49 Conclusiones finales La detección de la infección tuberculosa mediante el test de la tuberculina es imperfecta. Se han realizado esfuerzos para la estandarización de técnicas in vitro basadas en la respuesta inmunológica del huésped frente al patógeno.

50 Conclusiones finales Las técnicas actualmente disponibles se muestran como una posible alternativa al test de la tuberculina. Las investigaciones han de ir encaminadas a identificar nuevos antígenos específicos de M.tuberculosis para desarrollar técnicas in vitro para el diagnóstico de la infección tuberculosa aún más eficaces.

51 Conclusiones finales Los nuevos tests no sólo deben discriminar entre individuos sensibilizados de pacientes vacunados con BCG y infectados con micobacterias ambientales, sino también de cualquier potencial nueva vacuna contra la TB. En el futuro próximo quizás dispongamos de una técnica de laboratorio que sustituya al TST en el control de la TB.

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