Southern blot.

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1 Southern blot

2 DEFINICIÓN Nombrado así por Edward M. Southern quién desarrolló este procedimiento en la Universidad Edinburgh (1975). Técnica que se utiliza para identificar y localizar secuencias específicas de ADN mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas. Para el desarrollo de esta técnica se emplean dos herramientas: Las endonucleasas de restricción y las sondas o rastreadores moleculares.

3 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
Las endonucleasas son enzimas que van a hidrolizar los enlaces fosfofiestrer de los ácidos nucleicos. Las endonucleadas de restricción tienen la función de limitar la entrada de DNA extraño mediante el corte o escisión de unas secuencias identificadas específicas del DNA, llamadas secuencias de restricción o de identificación. Las endonucleasas de restricción tienen tres tipos: • TIPO I: Catalizan la metilación del DNA y la ruptura del DNA no metilada. • TIPO II: Sólo posee actividad nucleolótica. • TIPO III: Mutilan y rompen.

4 CORTES EXTREMO COHESIVO EXTREMO ROMO

5 FRAGMENTACIÓN DEL ADN POR ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS

6 SONDAS O RASTREADORES MOLECULARES
Las sondas son fragmentos de DNA de localización cromosómica conocida. Se obtienen de tres fuentes: Sondas de DNA genómico se extraen de preparaciones cromosómicas Sondas de DNA complementario (cDNA), se sintetizan a partir del rnRNA del gen de interés o en estudio; Sondas oligoaleloespecificas (sondas OAE) que rastrean directamente a los alelos mutados, se sintetizan químicamente.

7 DESARROLLO DE LA TECNICA
PASO 1 Se realiza la separación del ADN de alto peso molecular en pequeños fragmentos, mediante la acción de una enzima de restricción (endonucleasas), que es específica para cada tipo de fragmento.

8 PASO 2: Tras la acción de la enzima de restricción los fragmentos se separan de acuerdo a su tamaño molecular mediante un proceso de electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. En la electroforesis las moléculas de ADN, que están cargadas negativamente, se dirigen hacia el electrodo positivo, sin embargo, su velocidad de migración es interrumpida por el el gel de agarosa. De manera que las moléculas de menor peso se viene más deprisa que las de mayor peso. En consecuencia, se produce la separación de los fragmentos del ADN de acuerdo a su tamaño (los fragmentos más pequeños avanzan más distancia con respecto al punto de aplicación de la muestra).

9 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

10 PASO 3 Los fragmentos generados son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solución de transferencia es atraida a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana donde queda inmovilizado conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel.

11 PASO 4. Posteriormente se realiza la hibridación bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que la favorezcan. En esta etapa se incuba la membrana con la solución que contiene a la sonda marcada y previamente desnaturalizada, para que ésta se una, por complementariedad de bases nitrogenadas, a uno o varios de los fragmentos de restricción que contienen el gen detectable por la sonda. Luego de la hibridación, se lava la membrana para eliminar el exceso de sonda que no hibridó.

12 PASO 5: La localización de los fragmentos que han hibridado se realiza por autoradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva, si la sonda estaba marcada radiactivamente, o mediante otras técnicas, si se han usado sondas marcadas o compuestos no radioactivos. La interpretación se realiza mediante la observación de las bandas, por autoradiografia o colorimetría, que indican la presencia de ácido nucleico en la muestra que hibrida con la sonda aplicada. La ausencia de bandas señala la ausencia de secuencias complementarias

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14 UTILIDAD Este procedimiento se utiliza para determinar desajustes de genes, delecciones y, en casos particularmente favorables, cambios de bases individuales. En un diagnostico prenatal; si se le conoce la lesión génica y si se dispone de una sonda especifica, es posible el diagnóstico prenatal. El ADN de células obtenidas de cantidades tan pequeñas como 10 ml. de liquido amniótico (o por una biopsia de vello coriónico) se puede analizar por la técnica de SOUTHERN BLOT Se puede utilizar para determinar la herencia de determinados genes. Las mutaciones en los centros de restricción producen cambios en el tamaño de los fragmentos de restricción y, por lo tanto, en la posición de las bandas en el análisis de la transferencia SOUTHERN.

15 Esta técnica también se ha empleado para:
El diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias La distrofia muscular de Duchenne La hipoplasia adrenal congénita La deficiencia de glicerol-quinasa La distrofia miotónica severa Mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica crónica.

16 VENTAJAS

17 Alta especificidad y reproducibilidad.
Permitir la valoración del estado físico del ADN, y así poder valorar si el ADN viral está integrado en el genoma del huésped o permanece como episoma en el huésped. Es un método excelente para detectar pérdidas homocigóticas.

18 DESVENTAJAS

19 Su utilización tiene algunos inconvenientes derivados de su complejidad, costo y requerimientos de tiempo y esfuerzo. No permite determinar en forma precisa secuencias repetitivas de tamaño pequeño, lo que resulta extremadamente importante cuando necesitamos distinguir secuencias normales y premutadas.

20 No es posible identificar delecciones o rearreglos pequeños ubicados en la región que rodea la secuencia repetitiva. En ocasiones, el sitio de restricción específico de la enzima (EcoRI), se muestra refractario a la digestión, lo cual genera fragmentos adicionales que dan lugar al diagnóstico de falsos positivos para la mutación completa en estos pacientes.

21 APLICACIONES

22 Usos en la criminología o medicina forense

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24 Identificación de secuencias relacionadas en otras especies: Sonda→ cDNA del gen NF2 de ratón (neurofibromatosis type 2) hibridizado en un Southern blot contra muestras de DNA genómico de diferentes especies.

25 El análisis de la "huella dactilar de ADN" se basa en la técnica de transferencia e hibridación de Southern: La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.

26 Determinar desajustes de genes.
Nos ha permitido identificar muchos de los constituyentes estructurales de los ácidos nucleicos. Diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias. Para determinar la herencia de determinados genes. La técnica Southern blot también es utilizada para diagnosticar lesiones génicas en los pre-natales analizando muestras de liquido amniótico que es extraído a través de sondas.

27 Localiza una secuencia particular de la DNA dentro de una mezcla compleja.
Enfermedades genéticas como ANEMIA FALCIFORME, LAFIBOSISQUISTICA Y LA COREA DE HUNTINGTON pueden ser detectadas por el análisis del polimorfismo de longitud de los segmentos de restricción.

28 Tamizaje clínico y análisis de mutaciones en el gen FMR1 en 99 varones con características clínicas del síndrome de X-frágil Rev Chil Pediatr 77 (1); 34-42, 2006

29 Figura 1. Autorradiografía de Southern blot e hibridación con la sonda StB 12,3 marcada con ?-32P [dCTP]. 1A) Carril 1: Mujer normal. Carriles 2, 3 y 4: Probando hombre con mutación completa. 1B) Carril 1: Mujer normal. Carril 2: Probando con mutación completa y premutación (mosaico). 1C) Carril 1: Probando con mutación completa y metilación parcial. Carril 2: Mujer normal.

30 GRACIAS