PARTE II CAPÍTULO 14 METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

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1 PARTE II CAPÍTULO 14 METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
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2 una secuencia de poliadenilación.
Figura Vector de clonación y expresión. Un vector de clonación contiene elementos como el origen de replicación, un sitio múltiple de clonación (SMC), que es una secuencia específica reconocida por diversas enzimas de restricción para poder insertar el ADNc del gen de interés y un marcador de selección. Un vector de expresión se utiliza para producir una proteína recombinante y contiene, además de los elementos mencionados, un promotor y un sitio IRES (sitio de entrada interna al ribosoma), así como una secuencia de poliadenilación. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

3 Figura 14-2. Marcadores de selección
Figura Marcadores de selección. A) El gen LacZ es un marcador de selección que codifica para la enzima β-galactosidasa. Cuando la célula que contiene el plásmido se pone en contacto con el reactivo x-gal, las colonias de células transformadas se tiñen de color azul. B) Otro marcador de selección es el gen GFP, que expresa la proteína verde fluorescente que proporciona fluorescencia a la colonia celular cuando es expuesta a la luz ultravioleta. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

4 A B Figura Vectores de clonación. Los vectores de clonación se han creado con la finalidad de contener y permitir la amplificación de fragmentos de ácidos nucleicos. A) Un plásmido consta de componentes básicos como el sitio de clonación múltiple, un gene de resistencia y un sitio ORI. B) Los fagos provienen de la modificación del genoma ADNds lineal de virus bacterianos. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

5 C Figura (Continuación) C) Los cósmidos, como su nombre indica, combinan propiedades de los plásmidos con la presencia de los sitios COS del fago. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

6 D Figura (Continuación) D) Un BAC, o cromosoma bacteriano, permite la ligación de fragmentos grandes de ADN que contienen secuencias de resistencia a antibióticos, y sitio de clonación múltiple. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

7 E Figura (Continuación) E) Los YAC se construyen a partir de la ligación de fragmentos de ADN de gran tamaño con genomas de levadura modificados que contienen genes de resistencia a antibióticos, secuencias teloméricas y de codificación para centrómeros. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

8 Figura 14-4. Estrategia general de clonación
Figura Estrategia general de clonación. El procedimiento esquematizado consta de los siguientes pasos: preparación del vector para clonación, preparación del inserto de ADN a clonar, ligación del inserto de ADN con el vector, la transformación de bacterias y la identificación de las colonias que contienen el vector recombinante. Una vez que se obtiene el vector recombinante, puede utilizarse para producir proteínas recombinantes o para almacenar el ADN. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

9 Figura 14-5. Estrategias de clonación
Figura Estrategias de clonación. Según el tipo de extremos que se generan con el corte por las enzimas de restricción del vector e inserto que se va a clonar, se pueden tener las siguientes opciones: clonación de extremos romos con romos A), cohesivos con cohesivos B), o cohesivos con romos C). CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

10 Figura 14-5. (Continuación) Estrategias de clonación.
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11 Figura 14-6. Purificación del inserto a clonar
Figura Purificación del inserto a clonar. Después de la digestión enzimática con que es escindido el inserto del ADN de origen, el inserto se purifica del resto de la molécula de ADN de donde proviene, mediante una electroforesis en gel. En la imagen, un inserto es liberado empleando las enzimas Hind III y Xho I, y en la electroforesis se visualiza el fragmento digerido. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

12 Figura 14-6. Purificación del inserto a clonar
Figura Purificación del inserto a clonar. (Continuación) Un corte de la agarosa a la altura de la banda del inserto digerido lo aísla del resto de la molécula de origen que no haya liberado el inserto. Para extraer el inserto de la agarosa, se purifica el ácido nucleico empleando técnicas comerciales de extracción y purificación de ADN por columnas iónicas. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

13 Figura 14-7. Transformación de bacterias. A) Transformación química
Figura Transformación de bacterias. A) Transformación química. Para la transformación química se añade el plásmido deseado a las células químicamente competentes que se encuentran en una solución con CaCl2, que junto con el vector forma un complejo insoluble. Un choque térmico a 42 °C facilita la entrada del complejo ADN-CaCl2 a la célula. Se añade medio LB para que las células crezcan y se reproduzcan con el plásmido insertado. Posteriormente, se siembran en agar con antibiótico del gen de resistencia que contiene el plásmido y se seleccionan las colonias resistentes que contienen el vector recombinante. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

14 Figura 14-7. Transformación de bacterias
Figura Transformación de bacterias. B) Transformación por electroporación. En la transformación por electroporación la diferencia estriba en que en lugar de un choque térmico se aplican pulsos eléctricos que desestabilizan la membrana celular y permiten la entrada del vector. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

15 Figura 14-8. Producción de una genoteca de ADN complementario. Las
genotecas de ADNc se construyen a partir de la secuencia de ARNm, de los cuales se sintetiza el ADNc por retrotranscripción. El ARNm remanente es degradado, y la cadena complementaria del ADN de cadena sencilla para formar un ADN de doble cadena se sintetiza con ayuda de una ADN polimerasa. Los fragmentos de ADNc de doble cadena se clonan en el vector de elección. CAPÍTULO 14. VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN McGraw-Hill Education LLC Todos los derechos reservados. PARTE II. METODOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE