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Transferencia de material genético II Restricción (Digestión)

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Presentación del tema: "Transferencia de material genético II Restricción (Digestión)"— Transcripción de la presentación:

1 Transferencia de material genético II Restricción (Digestión)

2 Plásmido Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.

3 Características 1. ORIGEN DE REPLICACIÓN Capaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero 2. MARCADORES DE SELECCIÓN Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico 3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.

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6 ¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?

7 1.Absorbancia 260 nm 2.Electroforesis en geles de agarosa

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9 Microscopia de polímero de agarosa

10 Uso de colorantes

11 1. BROMURO DE ETIDIO 2. SYBER SAFE

12 Tinción con Bromuro de Etidio

13 Tinción con Syber Safe

14 Sensibilidad del colorante SYBER-SAFE ng Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con Bromuro de Etidio Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE

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17 Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado 1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambio aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa

18 M 1kb BamHI NdeI Inserto Gel de Agarosa al 1.5% Teñido con SYBER-SAFE 2X El plásmido obtenido se resuspendió en 20 L de H2O estéril. Posteriormente se tomaron 5 L para realizar la digestión correspondiente.

19 Restricción Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

20 Enzimas de restricción · Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

21 Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)

22 Enzimas de restricción Nomenclatura Ejemplo Corresponde a: E Escherichia Género de la bacteria co coli Especie de la bacteria R RY13 Cepa de la bacteria I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima

23 Extremos romos

24 Extremos cohesivos

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26 Plásmido

27 Usos de las enzimas de restricción

28 Identificación de muestra


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