EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR EN UN HOSPITAL COMARCAL

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1 EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR EN UN HOSPITAL COMARCAL
Buenos dias: Soy Ricardo Molina, responsable de la unidad de biología molecular del servicio de análisis clinicos del hospital. Hace unos 3 años decidimos crear una unidad de Biología molecular, que aglutinase todas la técnicas de biología molecular (técnicas de microbiología, hematología, oncologías, farmacogenética, etc, que dentro del contexto en el que nos movemos, un hospital comarcal, se pudieran realizar. La idea de montar la unidad vino de la creciente implantación de estas técnicas en la práctica clínica. Los primeros estudios de biología molecular parten de 1902 con los estudios sobre la alcaptonuria……. Dr. Ricardo Molina Gasset, Mayo 2012

2 Estudios sobre la alcaptonuria A. Garrod 1902
Beadle y Tatum Hipótesis "un gen-un enzima" Beadle y Tatum 1945 Bases moleculares de la anemia falciforme Pauling e Ingram 1949 Estructura de doble hélice del DNA Watson y Crick 1953 Técnicas de DNA recombinante varios Técnicas de secuenciación del DNA Maxam y Gilbert/Sanger Técnica de PCR Hapmap: El proyecto se formó en el año 2002 y su objetivo fundamental será examinar el genoma en relación con los fenotipos, al mismo tiempo permitirá desarrollar investigaciones sobre genes y variaciones genéticas que afecten a la salud y la enfermedad. Proyecto 1000 genomas: el Proyecto Genomas desarrollará un nuevo mapa del genoma humano que aportará una amplia visión de las variaciones biomédicamente relevantes del ADN, con una resolución superior a la hoy disponible Mullis 1985 Proyecto Genoma Humano varios Proyecto HapMap varios 2002- Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing) varios 2008-

3 Proyecto del genoma humano (2000) revolucionó la manera en la cual los científicos estudian los mecanismos moleculares de la enfermedades De 100,000 to 23,000 genes. Tests que identifican marcadores moleculares y genéticos de forma individual. Esos marcadores determinan el beneficio potencial de una terapia específica o el riesgo de desarrollar una enfermedad u otra condición de salud 3

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5 Industria del diagnóstico molecular
$5.5 Billones en el 2009 $8 Billones para el 2010 40 millones de test anuales en USA. En el futuro próximo serán 1/3 de todos los test diágnosticos 5

6 55% - Enfermedades infecciosas 23% - Cribado sanguineo
13% - Test genéticos 7% - Cancer Predicción de riesgos – Oncotipos. Detección temprana – Cromosoma X fragil. Clasificación de enfermedades – Leucemias. Terapia dirigida a determinadas dianas. Predicción de toxicidad y respuesta – Herceptin (Herp2). 6

7 BIOLOGÍA MOLECULAR Disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular Procesos celulares involucrados en la transferencia y transmisión de la información genética en la célula La medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las técnicas de la biología molecular en el estudio de las enfermedades humanas.

8 Dogma central de la biología molecular

9 CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS
Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales.... Germinales Somáticas (cáncer) Según el tipo de célula Según el tipo de alteración Mutaciones puntuales Inserciones y delecciones Cromosómicas Génicas numéricas estructurales Genéticas mitocondrial nucleares Según el genoma y cromosoma afectados Autosómicas Ligadas al sexo Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas

10 Biología molecular en las ciencias médicas
La medicina molecular La medicina genómica El diagnóstico molecular La farmacogenómica La terapia génica Avance en: Conocimiento de la patogenia de las enfermedades Desarrollo de novedosas estrategias terapéuticas Mejora de tratamientos farmacológicos Implementación de métodos diagnósticos precisos y exactos

11 Identificar marcadores para el diagnóstico temprano
Todas las enfermedades humanas poseen un componente genético bien hereditario o como resultado de la respuesta del organismo a los estímulos del medio, como las toxinas o los virus El genotipo relacionado con la génesis y evolución de la enfermedad. Con el conocimiento de las bases moleculares de las enfermedades es posible Identificar marcadores para el diagnóstico temprano Nuevos blancos terapéuticos Desarrollar estrategias terapéuticas novedosas y efectivas que en su conjunto permitan mejorar la atención a la salud La medicina molecular

12 Variaciones genotípicas: variaciones en la secuencia del DNA
Diferencias fenotípicas: Las diferencias morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y moleculares entre individuos de la misma especie Cambios en la secuencia del DNA con una incidencia > 1% Cambios en la secuencia del DNA con una incidencia < 1%. Polimorfismos (SNPs (polimorfismos de una sola base) explican alrededor del 90% de la diversidad fenotípica en el humano. Mutaciones

13 Susceptibilidad genética
Medicina genómica Estudio de los polimorfismos y su asociación con las enfermedades Susceptibilidad genética Polimorfismos que confieren propensión genética al desarrollo o complicaciones de ciertas enfermedades Predicción con cierta exactitud los riesgos de padecer enfermedades donde los genes jueguen un papel fundamental Predicción de evolución de la enfermedad y su respuesta a las terapias farmacológicas Aplicación de medidas preventivas que limiten o incluso eviten la enfermedad y mejora en los tratamientos

14 Dot Blot Diagnóstico Molecular. Las técnicas generadas por la Biología Molecular ofrecen ventajas sobre las técnicas convencionales en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y adquiridas.

15 Farmacogenómica Se trata una enfermedad, no al individuo. Responde Responde No responde Muy poco Toxicidad ¯ Dosis ­ Dosis Responde No responde Muy poco

16 RESPONDEDORES NO RESPONDEDORES Un medicamento funciona bien en una persona pero poco o nada en otra con la misma patología. EFECTOS SECUNDARIOS ADVERSOS Unas personas los toleran bien mientras que otras desarrollan efectos adversos.

17 FACTORES QUE CONDICIONAN ESTA RESPUESTA DIFERENCIAL
EDAD SEXO, PESO ENFERMEDADES GENES INTRÍNSECOS ESTADO NUTRICIONAL HÁBITOS DE VIDA (DIETA, TABAQUISMO, ALCOHOL, DROGAS) AMBIENTE OTROS MEDICAMENTOS EXTRÍNSECOS

18 Farmacogenómica: Evalúar la influencia de los polimorfismos genéticos en la respuesta a los fármacos Reacciones individuales tanto terapéuticas como toxicas Las evaluaciones farmacogenómicas permiten aumentar la eficiencia y bioseguridad de los tratamientos farmacológicos para generar un tratamiento justo a la medida del genotipo.

19 Vía principal en el metabolismo de los fármacos
Oxidación por familia de enzimas hepáticas:CYP450 Proporción de fármacos Metabolizados por algún miembro de P450 CYP2D6 CYP2C9/10 CYP21A2 CYP2A6 CYP2C19 CYP2E1 CYP3A

20 Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador
Genotipo Tipo de respuesta a dosis típicas Ultrarápido Conc. = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Tiempo Actividad normal Actividad reducida Eficiente = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Intermedio = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo no actividad Lento = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo

21 Familia CYP2

22 Farmacogenómica: Enzimas citocromo P450 Se ha estimado que una dosis diaria de mg de nortriptilina es suficiente para un paciente metabolizador lento CYP2D6 y, sin embargo, un metabolizador ultrarrápido que herede múltiples copias del gen requeriría más de 500 mg al día Enzimas glutatión S-transferasas Numerosos estudios reportan asociación entre los polimorfismos en los genes GST y la eficacia y/o toxicidad en la quimioterapia del cáncer

23 TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

24 Hemocromatosis: Grupo de trastornos caracterizados por depósito de hierro en el organismo
Hemocromatosis hederitaria: Grupo de trastornos genéticos caracterizados por aumento en la absorción intestinal y depósito de hierro en el organismo Mayoría: mutación gen HFE 80-90% homocigotos para mutación C282Y

25 Causas de sobrecarga de hierro
Hemocromatosis hereditarias ASOCIADA AL GEN HFE No asociadas al gen HFE H juvenil (2A hemojuvelina, 2B hepcidina), H asociada receptor transferrina 2, ferroportina 1, mutación en la ferritina H Sobrecargas de hierro secundarias Enfermedades hematológicas Talasemia mayor, A. sideroblásticas, A. hemolíticas crónicas, A. aplásicas… Sobrecarga parenteral de hierro: transfusiones de hemoconcentrados, hierro iv, hemodiálisis, Enfermedades hepáticas crónicas Hepatitis B y C, enfermedad hepática alcohólica, EHNA,etc Miscelánea Hemocromatosis neonatal, Atransferrinemia, Aceruloplasminemia

26 La mutación C282Y impide la unión de HFE con β-2-microglobulina (β 2M) y, por tanto, su transporte hasta la membrana basolateral de la células de las criptas y su unión al receptor de la transferrina (TfR). En esta situación disminuye la entrada de hierro en el interior de la célula de la cripta. Esta sideropenia intracelular conduce, mediante el sistema IRP/IRE (Iron Regulatory Proteins/Iron Responsive Element), a un aumento de la expresión de los transportadores de hierro DMT-1 y ferroportina 1 en el transcurso de la maduración de la célula críptica a enterocito, por lo que en éste último se producirá un aumento de la absorción de hierro desde la luz intestinal.

27 Disminución de Hepcidina por mutación HFE
MUTADO La mutación C282Y impide la unión de HFE con β-2-microglobulina (β 2M) y, por tanto, su transporte hasta la membrana basolateral de la células de las criptas y su unión al receptor de la transferrina (TfR). En esta situación disminuye la entrada de hierro en el interior de la célula de la cripta. Esta sideropenia intracelular conduce, mediante el sistema IRP/IRE (Iron Regulatory Proteins/Iron Responsive Element), a un aumento de la expresión de los transportadores de hierro DMT-1 y ferroportina 1 en el transcurso de la maduración de la célula críptica a enterocito, por lo que en éste último se producirá un aumento de la absorción de hierro desde la luz intestinal.

28 Autosómica recesiva. 3 mutaciones gen de HFE (brazo corto crom. 6)
S65C (Ser por Cys). La menos importante Pese a que se expresa en membrana y se une a B2M, está afectada la zona de unión entre HFE y sTfR. Solo tienen algo de penetrancia (< 1%) en heterocigosis mixta con C282Y. Se llama, también, mutación benigna. Muy poco prevalente en España. H63D (Hys por Asp) Se altera la estructura terciaria, se expresa en membrana y se une a B2M, no es capaz de bloquear la unión HFE- sTfR. Solo tienen penetrancia relevante (aunque menor que en el caso anterior) si son heterocigotos mixtos con C282Y. C282Y (Cys por Tyr). La principal No se une a la b2M y no se expresa en membrana. Alta penetrancia para homocigotos. Más en > 40 años. Más en hombres. Incluso para homocigotos C282Y de > 40 años, aunque la sobrecarga férrica es habitual (♀: 80% - ♂: 95%), no lo es la sintomatología (♀:13% - ♂:15%). Autosómica recesiva. 3 mutaciones gen de HFE (brazo corto crom. 6)

29 Enfermedad genética más frecuente en Occidente
Portadores 10% Prevalencia de HH: 1/ europeos caucásicos Europa: Norte: 80-90% C282Y-C282Y Cuenca mediterránea: 50-70% C282Y-C282Y Mayoría asintomáticos 40 – 50 años 10 ♂: 1♀ C282Y H63D % +/+ -/+ -/- 85% 5% 10%

30 Cribado del gen de la hemocromatosis en el laboratorio
Campo de aplicación: pacientes de primaria Ferritina > 400 en dos análisis Reactantes de fase aguda negativos (PCR < 0.5) Marcadores Hepatitis negativos Enzimas hepaticas no mayores de 200 Hemoglobina > 12 mujeres o 13 hombres (descartar anemias hemoliticas, sideroblasticas o megaloblasticas)

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34 Prevalencia en España de los genotipos HFE
GENOTIPO HFE FRECUENCIA% IC 95% HOMOCIGOTOS C282Y HETEROCIGOTOS C282Y HOMOCIGOTOS H63D HETEROCIGOTOS H63D C282Y/H63D Prevalencia de la población estudiada en Alcoy de los genotipos HFE GENOTIPO HFE FRECUENCIA % HOMOCIGOTOS C282Y 2.3 HETEROCIGOTOS C282Y 7.5 HOMOCIGOTOS H63D 9.1 HETEROCIGOTOS H63D 28.9 HETEROCIGOTOS S65C 0.8 C282Y/S65C 0.2 C282Y/H63D 5.5

35 TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FV Leiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

36 Trombofilias hereditarias
Resistencia a la PCa (FV Leiden) Aumento de Protombina (G20210A) Hiperhomocisteinemia

37 Resistencia a la PCa y Factor V Leiden
VIII Calicreína PK HMWK XII colágeno XIIa Daño Vascular VI XI XIa IXCa IXa-VIIIa VE FT VII VIIa VIIa-FT Sist. PC Se inactiva por rotura de su cadena pesada por el complejo PCa (rotura Arg506) Mutación de guanina por adenina en nucleotido 1691 (FVleiden), cambia Arg506 por Glut y se hace resistente a la acción de la PCa cofactor de conversión de protombina a trombina V se activa por la trombina Ca+2 X Xa-Va Protombina Trombina Fibrinógeno Fibrina Fibrina estable XIII XIIIa Ca+2 Ca+2

38 Resistencia a la PCa G1691A A A A C C Pca Trombina
20-25% de las trombosis venosas (Casos seleccionados) Mutación en el gen del FV (FV Leiden) G1691A A A A C C Pca Trombina FV Leiden: Menos sensible a la degradación por PCa Actividad procoagulante aumentada Gen FV, crom 1, 25 exones H2N COOH Arg Arg Glu

39 Factor V Leiden Apacere en: -Heterozigosis (95% casos) -Homozigosis (1% casos) -FV leiden + déficit FV (pseudohomozigotos) -Mayor riesgo si aparece junto a déficit de PS, PC, AT, polimorfismo de la protombina, niveles elevados FVIII, hiperhomocistinemia, embarazo, anticonceptivos orales, terapia hormonal sustitutoria -Factor de riesgo genético para trombofilias, mas frecuente en paises occidentales -Homozigotos tienen clínica de trombosis venosa -Heterozigotos suelen ser asintomáticos

40 POLIMORFISMO de la Protrombina
5´ G 3´ 20210 Genotipo 20210G Genotipo 20210A [ Protrombina ] en plasma 1,05 U/ml 1,32 U/ml Coagulación normal Riesgo

41 Polimorfismo G20210A del Gen de la Protombina
5´ 3´ Gen de Protombina, 14 exones G20210A Síntesis de Protombina (mayor nivel en plasma; 30%) Asociación con trombosis venosa y tromboembolismo pulmonar 3-6 veces el riesgo de T. venosa ( asociado a ACO)

42 Homocisteína (Hcy) Aminoácido tiól No esencial
Intermediario en el metabolismo de la Metionina

43 B12 La homocisteína es metabolizada fundamentalmente a través de 2 posibles vías: la remetilación y la transulfuración. (MTHFR)

44 5,10 Metilentetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)
Mutación C677T Ala Val MTHFR termolábil de Homocisteína plasmática (pHcy) Factor de riesgo de Trombosis Enzima con menor actividad 30-40% menos en heterozigótos, 60-70% menos en homozigótos)

45 Hiperhomocisteinemia y Trombosis
Daño directo del endotelio Disminución de expresión de la Trombomodulina Disminución de actividad de la PC Aumento de actividad de FV Aumento de la actividad plaquetaria

46 TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

47 KRAS Homólogo humano del Oncogen Kirsten Rat Sarcoma Virus
KRAS es un proto-oncogen, es una proteina de la cascada de transducción de señal del EGFR (RTK) Es una GTPase: el GTP se hidroliza a GDP inactivando el RAS, asegurando que la transducción de señales no es eterna. The oncogene K-RAS was discovered in the Kirsten Rat Sarcoma Virus. Later it was realized that K-RAS was one individual of a class of oncogenes, RAS. K-RAS is th human homologue of To understand the function of K-RAS, we should understand how the EGFR signal transduction pathway is working. EGFR belongs to the family of Receptor Tyrosine Kinases (RTK) Growth factors bind to the EGFR, the Epidermal Growth Factor Receptor a transmembrane protein. Binding of GF to EGFR stimulates the receptor‘s intrinsic protein-tyrosine kinase activity, which subsequently stimulates a signal-transdurction cascade. Binding of a GF to EGFR leads to cell proliferation. After binding of a GF to EGFR, the signal is transduced in many steps by phosphorylation (kinase cascade). RTK proliferación diferenciación supervivencia modulación del metabolismo

48 Anticuerpos Monoclonales Anti-EGFR
Un descontrol en la cascada del EGFR puede ser la causa de procesos neoplásicos debido a un incremento en el número de receptores del EGF Anticuerpos monoclonales anti-EGFR se unen al dominio extracelular del EGFR bloqueando la unión del ligando y la activación del receptor. Cetuximab (Erbitux) – Merck Panitumumab (Vectibix) – Amgen Anti-EGFR monoclonal AB bind to the extracellular domain of EGFR and block ligand binding and receptor activation.

49 Fármacos Anti-EGFR y mutaciones del KRAS
Mutaciones del KRAS (RAS) conducen a una transducción de señales independientes del EGFR (RTK) Las terapias Anti- EGFR no son útiles en células tumorales que contienen KRAS mutado. . RAS Mutado se une al GTP pero no puede hidrolizarlo a GDP RAS siempre está en su ESTADO ACTIVO Descontrol de la transducción de señales Estimulación permanente de la proliferación celular CANCER

50 >97.0% mutationes occurren en los codones 12 and 13
Mutaciones del KRAS Mutationes en el gen KRAS ocurren con una frecuencia del % en pacientes con Cáncer Colorrectal metastásico Most of the mutations on the KRAS gene are confined to codon 12 Cosmic ID: Identification in Cosmic database. Cosmic = Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ( >97.0% mutationes occurren en los codones 12 and 13

51 K-RAS: Utilidad clínica
Orientación de terapias anti-EGFr (m-CRC) en cáncer de colon metastásico K-RAS wt (35-45%): fármacos anti-EGFr (antireceptor de factor de crecimiento epidérmico) fármacos anti-VEGF (antifactor de crecimiento endotelial antivascular) mut (55-65%): fármacos anti-VEGF Biomarcador de pronóstico: Cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) Cáncer de pancreas Cáncer de vejiga Terapias anti-EGFR eficaces sólo en pacientes con K-RAS no mutado

52 TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia: Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV Hematología: Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR , Gen Hemocromatosis Oncología: Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF Farmacogenómica: Genotipo IL28B

53 Predictores de respuesta terapia Hepatitis C
Factores huésped Edad Sexo Etnia Alcohol Resistencia Insulina Fibrosis/Cirrosis Adherencia Genética Factores virales Carga viral Genotipo Cuasiespecies Factores del tratamiento Régimen Dosis y duración Efectos adversos

54 Promotor de la IL28B en posición -3176 C/T (rs12979860)
Polimorfismo Promotor de la IL28B en posición C/T (rs ) Genotipo CC > tasa aclaramiento espontáneo del VHC Tillmann HL. Gastroenterology. 2010;139: Mayor eficacia del tratamiento antiviral con interferón Genotipo CC >respuesta viral rápida Thompson AJ, et al. Gastroenterology. 2010; 139:120-9. Genotipo CC >2 veces respuesta viral sostenida 55-80% genotipo CC, 20-40% genotipo CT o TT Ge D, et al. Nature. 2009;461: Suppiah V, et al. Nat Genetics. 2009;41: Tanaka Y, et al. Nat Genetics. 2009;41: Thompson AJ, et al. Gastroenterology. 2010; 139:120-9.

55 Polimorfismo IL28B (rs 12979860 CC) se asocia con RVS
1628 pacientes HCV G1 Ge D, et al. Nature. 2009;461: 55 55

56 Predictores de RVS con Interferón/Ribavirina
Caucásicos (n = 871) Afro Americanos (n = 191) Hispanos (n = 75) Factores Asociados con RVS Odds Ratio (IC 95%) 7.3 4.2 Genotipo IL28B rs (CC vs TT) 3.0 6.1 5.1 HCV RNA Basal (< vs ≥ 600,000 IU/mL) CI, confidence interval; pegIFN, peginterferon; RBV, ribavirin; SVR, sustained virologic response. More recently, IL28B genotype has been identified as a strong predictor of SVR with peginterferon/ribavirin. There is a patent on this discovery, and we will see whether this becomes part of patient management in the future. We are now seeing the first data on IL28B genotype in the early phase II studies of response-guided therapy with the investigational protease inhibitors. However, if triple therapy can confer 90% rapid virologic response rates, IL28B genotype will be less important with these new regimens than it is for peginterferon plus ribavirin standard of care of today. For more information, go online to: 1.1 5.6 Fibrosis Basal (METAVIR F0-F2 vs F3-F4) 2.4 4.1 1.0 10.0 Ge D, et al. Nature. 2009;461: 56

57 Prevalencia de Alelos IL28B explicar variación geográfica en RVS
En Europa predice la respuesta al tratamiento con Interferón/Ribavirina Thomas DL, et al. Nature. 2009;461:

58 Tecnicas que se podrían incorporar en el laboratorio de Biología molecular de este hospital

59 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

60 Frecuencia de tolerancia a la lactosa en el mundo
TOLERANTE INTOLERANTE

61 Bases moleculares para la tolerancia a la lactosa
LCT C/T G/A D2S3010 D2S3013 D2S3015 D2S3016 El alelo T de un polimorfismo C/T localizado en una región potencialmete reguladora Kb arriba del gen de la lactasa se encontro que esta asociado con persistencia a la lactasa en población del Norte de Europa. Su frecuencia iguala la frecuencia de las lactosa persistentes esperados de test de hidrogeno espirado Estamos ante un nuevo test de tolerancia de la lactosa El alelo A de G/A polimorfismo está altamente, pero no completamente asociado en las mismas poblaciones

62 Evidencia de asociación
kb C/T locus NO PERSISTENTE CC PERSISTENTE CT TT kb G/A locus NO PERSISTENTE GG PERSISTENTE AG AA

63 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORAR AL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

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65 POLIMORFISMO APOE 1. Alelos: E2 (cisteínas en 112 y 158)
E3 (cisteína en 112 y arginina en 158) E4 (argininas en 112 y 158) 2. Genotipos: E2-E2 ( 1.5%) E2-E3 (11.5%) E3-E3 (72.6%) E3-E4 (13.0%) E2-E4 ( 0.5%) E4-E4 ( 0.8%) 3. CT y LDL-colesterol muy altas entre los portadores del alelo E4. 4. E4 => hiperreactividad a cambios dieta e hiporespuesta a estatinas. 5. E4 => factor de riesgo para demencias y EA 6. La respuesta al tratamiento con Tacrine en pacientes con Alzheimer : E2-E3 respuesta 4 veces mayor que E4-E4. (Farlow, et al, 1996 Ann NY Acad Sci 802: )

66 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

67 CYP2D6 El citocromo P450 son monooxigenasas las cuales catalizan muchas reacciones envueltas en el metabolismo de las drogas. El citocromo P450 2D6 (CYP2D6) esta localizado en el hígado y metaboliza sobre el 20% de los fármacos de uso común, en particular agentes cardiovasculares y psicotrópicos.

68 β-bloqueantes: Carvedilol, Metoprolol
Antiarrítmicos de Clase I: Lidocaina, flecainida, Clorfenamina, Debrisoquina, Metoclopramid, Ondansetron, Tropisetron Opioides: Codeína, Tramadol, Dextrometorfano Antidepresivos: Imipramina, Amitriptilina, Notriptilina, Venlafaxine, Fluoxetine, Paroxetine, Tamoxifen, Vincristina Sustratos del CYP2D6 Antihistamínicos: Clorfenamida, Difenidramina Antipsicóticos: Clorpromazina, Haloperidol Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina: Citalopram, Fluoxetina Bupropion, Celecoxib, Cimetidina, Clomipramina, Cocaina, Doxorubicina, Metoclopramida Metadona, Moclobemida, Quinidina, Ranitidina, Ritonavir, Terbinafina Inhibidores del CYP2D6 Dexametasona Rifampicina Inductores del CYP2D6

69 Fenotipo asociado a cada alelo (población Caucasiana)
Gen altamente polimórfico, con un gran número de alelos identificados, teniendo relevancia médica los alelos CYP2D6*3, CYP2D6*4 y CYP2D6*6 Fenotipo asociado a cada alelo (población Caucasiana) Alelo Actividad Enzimática Frecuencia CYP2D6*1 Actividad normal % CYP2D6*2 Actividad normal % CYP2D6*3 Ausencia total de actividad metabólica % CYP2D6*4 Ausencia total de actividad metabólica % CYP2D6*5 Ausencia total de actividad metabólica % CYP2D6*6 Ausencia total de actividad metabólica % CYP2D6*8 Ausencia total de actividad metabólica CYP2D6*9 Disminución de la actividad enzimática % CYP2D6*10 Disminución de la actividad enzimática % CYP2D6*14 Ausencia total de actividad metabólica CYP2D6*17 Disminución de la actividad enzimática CYP2D6*35 Aumento de la actividad enzimática % CYP2D6*41 Disminución de la expresión génica %

70 Principales alelos según su funcionalidad en población Caucasiana
Alelos funcionales: *1, *2,*35 Alelos parcialmente funcionales: *9, *10, *17, *41 Alelos no funcionales: *3, *4, *5, *6 Diferencias Interétnicas según los tipos de alelos Etnia Alelos Alelos Alelos funcionales no funcionales parcialmente funcionales Caucasianos % % (CYPD6*4) % Asiáticos % % % (CYP2D6*10) Africanos % %(CYPD6*4,*5) % (CYP2D6*17) La detección de las variantes alélicas de CYP2D6 permite una farmacoterapia individualizada y mas segura.

71 Prevalencia en poblacion caucasica
Tipo metabolización Prevalencia en poblacion caucasica metabolizadotes ultrarrápidos: múltiples copias del gen funcional La frecuencia de dicho fenotipo en la población Caucasiana puede variar entre 1-10%. metabolizadores lentos : 2 copias (combinadas de cualquier modo) de estos 4 alelos: CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5 y CYP2D6*6 metabolizadores intermedios: heterocigotos, con un alelo funcional y otro no funcional, o bien homocigotos para alelos parcialmente funcionales.. metabolizadores rápidos: heterocigotos u homozigotos para alelos funcionales. 1-10%. 80-94%. 5-10%.

72 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORAR AL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

73 CYP2C19 El gen es polimórfico con mas de 20 alelos
Los alelos CYP2C19*2 y CYP2C19*3 tiene relevancia, porque presentan una actividad enzimática disminuida En el CYP2C19*2 hay una sustitución de G681>A causando un error de lectura y produciéndose una proteína modificada En el CYP2C19*3 hay una sustitución de G636>A creándose un codón de parada anterior y produce una proteina truncada

74 Antidepresivos: amitriptilina, citalopram, clomipramina, fluoxetina, imipramina, moclobemida
Antiepilépticos: fenitoína, fenobarbitona, S-mefenitoína Benzodiacepinas: diazepam Inhibidores bomba protones: lansoprazol, omeprazol, pantoprazol Miscelánea: carisoprodol, ciclofosfamida, hexobarbital, indometacina, R-mefobarbital, nelfinavir, nilutamida, primidona, progesterona, proguanil, propanolol, tenipósido, (R)-warfarina (8-OH) Sustratos del CYP2C19

75 Polimorfismo del CYP2C19:
CYP2C19*1: Alelo normal CYP2C19*2: Alelo actividad disminuida CYP2C19*3: Alelo actividad disminuida Distribución de los atendiendo a su genotipo: GENOTIPO FENOTIPO Homozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*1 - metabolizadores rápidos. Heterozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*2 - metabolizadores rápidos. Heterozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*3 - metabolizadores rápidos. Homozigoto CYP2C19*2 // CYP2C19*2 - metabolizadores lentos. Homozigoto CYP2C19*3 // CYP2C19*3 - metabolizadores lentos. Heterozigoto CYP2C19*2 // CYP2C19*3 - metabolizadores lentos.

76 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

77 Accenocumarol inhibe el ciclo de la Vitamina K
Epoxido Reductasa  -Carboxylasa (GGCX) Accenocumarol Inactivación CYP2C9 Farmacocinética Factores de coagulacion Vit. K dependientes (FII, FVII, FIX, FX, Protein C/S)

78 CYP 2C9*2 y CYP 2C9*3 El Citocromo P-450-2C9 localizado en el hígado metaboliza fármacos de uso común: : S-warfarin, Ibuprofen, Diclofenaco, accenocumarol. El gen es polimórfico. Los alelos CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*6, CYP2C9*15 Y CYP2C9*25 son inactivos. Los pacientes con un genotipo metabolizador lento probablemente necesitan dosis mas bajas de S-Warfarina o Acenocumarol, teniendo mayor riesgo de sangrado.

79 Metabolismo del Acenocumarol en función de los polimorfismosCYP2C9:
La principal via para la eliminación del acenocumarol es a través de la oxidación en el hígado por el CYP2C9 Metabolismo del Acenocumarol en función de los polimorfismosCYP2C9: CYP2C9*1 (salvaje) normal CYP2C9*2 (Arg144Cys) - bajo/intermedio CYP2C9*3 (Ile359Leu) - bajo Frecuencia de alelos CYP2C9 de bajo metabolismo: Europeos: CYP2C9* % CYP2C9* % Asiaticos: CYP2C9* % CYP2C9* % Africanos: CYP2C9* % CYP2C9* % The other important factor is the CYP2C9 variant alleles occur at an appreciable frequency in the general population.

80 Accenocumarol inhibe el ciclo de la Vitamina K
Epoxido Reductasa  -Carboxylasa (GGCX) Accenocumarol Inactivación CYP2C9 Farmacocinética Factores de coagulacion Vit. K dependientes (FII, FVII, FIX, FX, Protein C/S)

81 VKORC1 La subunidad 1 del complejo vitamina K epoxi (VKORC1) es una proteína de membrana localizada en los hepatocitos. VKORC1 tiene un papel importante en la ruta de la vitamina K, la cual es esencial para la coagulación. Alta actividad de VKORC1 esta asociada con un incremento de la eficiencia de la coagulación. El efecto anticoagulante de los derivados cumarínicos es por la inhibición de la actividad VKORC1. Los polimorfismos C1173T y G-1639A reducen la actividad de VKORC1 y así aumenta el efecto de los derivados cumarínicos.

82 POLIMORFISMOS VKORC1 Genotipo Fenotipo Dosis Polimorfismo 1173 CC Homozigoto salvaje Normal CT Heterozigoto TT Homozigoto mutante Lento Reducida Polimorfismo 1639 GG GA AA

83 VKORC1 afecta a la rapidez de respuesta del ciclo de la vitamina K
Polimorfismo 1639 1 dosis oral de accenocumarol 30% de cambio en INR Bodin, et al. Blood 2005

84 TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas: Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6 Genotipo Apo E Farmacogenómica: Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4 Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3 Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3 Deteccion polimorfismos VKORC1 Varios: Genotipo alfa 1 antitripsina

85 ALFA 1 ANTITRIPSINA Proteína circulante producida en el hígado. Formada por 394 aminoácidos con tres cadenas laterales carbohidratadas. Inhibe proteasas (sobre todo elastasa). Protege los tejidos de ser dañados por la enzima elastasa presente en los neutrófilos, monocitos y eosinófilos. Cuando hay déficit el tejido pulmonar es uno de los más afectados.

86 ALFA 1 ANTITRIPSINA

87 DÉFICIT ALFA 1 ANTITRIPSINA
Trastorno hereditario producido por alteración de alfa 1 antitripsina. Puede cursar con clínica respiratoria y hepática. El déficit aumenta la proteolisis y deposito de proteínas anormales en los tejidos. Los signos clínicos de defecto genético son bronquitis y en casos mas severos enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y hepatitis. Afecta 1/2500 y 1/3000. Enfermedad respiratoria afecta entre los 30 y 40 años de edad. Es una de las causas más frecuentes de trasplante hepático en niños.

88 FISIOPATOLOGÍA ALFA 1 ANTITRIPSINA
Cuando la proteína AAT es defectuosa, la velocidad de liberación al torrente circulatorio por los hepatocitos disminuye y se acumula en el hígado Ocasionando una deficiencia de AAT en la sangre Daño pulmonar por la elastasa. Daño hepático en algunos pacientes

89 GEN Serpina 1 Cromosoma 14q32.1 Longitud de 12,2kb. Formado por 7 exónes Exones II-V codifican el centro activo (metionina 358) El alelo deficitario más importante de la AAT (alelo Z)

90 VARIANTES ALFA 1 ANTITRIPSINA
La AAT normal se denomina M Las variantes más frecuentes que producen enfermedad son la Z y la S. Variante Z: Mutación G11940A codificando E342K (glutamato a lisina ) Variante S: Mutación T9628A codificando E264V (glutamato a valina )

91 GENOTIPOS NORMAL La mayoría tienen dos genes normales M (genotipo MM)
Niveles normales de AAT. DEFICIENTES Los dos alelos deficientes más frecuentes son el S y el Z. El 3% de la población caucásica es portadora de S o Z. El gen Z es considerado deficiente grave. El gen S es considerado deficiente leve. Deficientes raras “M-like”, como la variante MMalton “S-like”, como la SSiiyama.

92 DEFICIENCIA GRAVE GENOTIPO ZZ (IPZZ: 10-15%) El 95% de las personas con Deficiencia de AAT tienen 2 genes Z (Pi ZZ) Nivel AAT menor del 10% del normal. Desarrollo enfermedad pulmonar Solamente un 5% de los Pi ZZ desarrollan enfermedad hepática crónica. DEFICIENCIA INTERMEDIA GENOTIPO SZ (IPSZ: 40% ) Con niveles sobre los considerados protectores Riesgo incrementado de desarrollar enfermedad pulmonar GENOTIPO MZ (IPMZ: 60% ) Suelen tener un nivel de AAT en torno al 60% de los valores normales Generalmente no desarrollan enfermedad, pero los fumadores, tienen un riesgo mayor para el desarrollo de EPOC. Mayor riesgo de desarrollar una enfermedad hepática crónica en presencia de factores de riesgo como la exposición al virus de la hepatitis y el alcohol. DEFICIENCIA LEVE GENOTIPOS SS(IPSS: 60%) y MS (IPMS: 80%) Nivel de AAT al 60-80% de los valores normales. El riesgo de enfermedad pulmonar o hepática es muy pequeño