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«EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO α- NAFTALENACÉTICO (ANA), 6- BENCILAMINOPURINA (BAP) Y ÁCIDO GIBERÉLICO (GA 3 ) EN LAS FASES DE INDUCCIÓN, MULTIPLICACIÓN.

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1 «EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO α- NAFTALENACÉTICO (ANA), 6- BENCILAMINOPURINA (BAP) Y ÁCIDO GIBERÉLICO (GA 3 ) EN LAS FASES DE INDUCCIÓN, MULTIPLICACIÓN Y ENRAIZAMIENTO IN VITRO A PARTIR DE YEMAS APICALES DE Valeriana scandens ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Previo a la obtención del título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA MARIA JOSE BASANTES MANTILLA SANGOLQUÍ, NOVIEMBRE DE 2011

2 Valeriana scandens especies mas distintivas del género valeriana extensivo uso en la elaboración de fitomedicinas Ansiedad Insomnio Tensión nerviosa (principalmente) CONTROL INVIMA aprobadas 2 especies V. officinalis L. (origen europeo) V. scandens abundantes en los Andes del Ecuador y Perú INTRODUCCIÓN

3 Tiempos memorables Valeriana rizoma virtudes medicinales ésteres de iridoides bicíclicos valepotriatos (0,5-2 %) reequilibradores generales del sistema nervioso Páramo Andino prácticas antropogénicas afectado Quemas Sobrepastoreo Introducción animales deterioran la capa superficial del suelo alto grado de vulnerabilidad ESPECIES

4 Plantas En la industria Presentan características valiosas explotadas sin que haya un control VALERIANA no cuenta con prácticas de cultivo programado su distribución con los años ha llegado a ser escasa vital importancia Repoblarla Extraer sus metabolitos secundarios Gran herramienta para la industria medicinal. recuperarla

5 Valeriana scandens: Características de la planta Enredadera perenne Muy ramificada, con presencia de entrenudos Hojas: Opuestas y c/par en dirección perpendicular al par que sigue, compuestas de folíolos Flores: Pequeñas, numerosas, agrupadas en inflorescencias grandes, ramificadas, con presencia de brácteas Presentan dos tipos de flores, bisexuales y femeninas Fruto: Aquenio oblongo-linear u oval, con segmentos largos y plumosos que representan el cáliz desplegado

6 PROPAGACION CLONAL Preparación y selección de plantas donadoras Establecimiento del cultivo aséptico Inducción de brotes Multiplicación de brotes 4 EnraizamientoAclimatación 5 6

7 OBJETIVOS Evaluar el efecto de ácido α naftalenacético (ANA), 6- bencilaminopurina (BAP) y ácido giberélico (GA 3 ) en las fases de inducción, multiplicación y enraizamiento in vitro a partir de yemas apicales de Valeriana scandens Establecer un método de desinfección para las yemas apicales de Valeriana scandens a fin de controlar los agentes contaminantes. Evaluar la concentración de ANA y BAP adecuada para la inducción de brotes. Evaluar la concentración de ANA y BAP adecuada para la etapa de multiplicación. Evaluar el efecto de GA 3 en el alargamiento de brotes previo al enaizamiento. Evaluar la concentración ideal de ANA para utilizarla como hormona de enraizamiento in vitro en los medios de cultivo M&S y B5 Específicos

8 METODOLOGÍA TratamientoConcentración Cloro (%)Tiempo (min) T10.53 T213 T31.53 T40.55 T515 T61.55 Contaminación.- 0 CONTAMINADO; 1 NO CONTAMINADO. Necrosis.- 0 NECROSADO; 1 NO NECROSADO. Muerte.- 0 MUERTO; 1 VIVO. Fase de desinfección Tratamientos aplicados para la desinfección de yemas apicales

9 A D E F B C Figura 1 (A) Yemas que van a ser sometidas a desinfección, (B) Lavado con detergente por 10 minutos (C) lavado con agua estéril por 5 minutos (D) Lavado con fungicida por 10 minutos (E) Inmersión en alcohol por 1 minuto (F) Inmersión en hipoclorito de sodio por 5 minutos

10 ABC (A) Explante viable (B) Explante con contaminación fúngica (C) Explante con contaminación bacteriana AB Representación gráfica de las condiciones de necrosis y muerte del tejido (A) Explante muerto (B) Explante necrosado.

11 Fase de inducción de brotes TratamientoBAP (mg L -1 )ANA (mg L -1 ) Control00 I110 I210.1 I310.5 I411 I520 I620.1 I720.5 I821 I930 I I I1231 Aparecimiento de brotes.- 0 PRESENCIA; 1 AUSENCIA Formación de callo.- Niveles 1 a 4 Tratamientos para inducción de brotes Número de entrenudos.- Contabilizó el número de entrenudos que desarrolló c/ explante Longitud de los brotes.- Longitud en centímetros que alcanzaron los nuevos brotes BRA : 1mg L -1

12 (A) Ausencia de callo (B) Poca formación de callo (C) Mediana formación de callo (D) Abundante formación de callo. A B C D

13 Fase de multiplicación de brotes TratamientoBAP (mg L -1 )ANA (mg L -1 ) M1 M2 M3 M4 0 0,5 1 0,5 0 0,05 0,1 Número de entrenudos.- Contabilizó el número de entrenudos que desarrolló c/explante Vigorosidad de los nuevos brotes.- Se estableció niveles del 1 al 4, siendo 1 un brote débil y 4 un brote vigoroso Longitud de los brotes.- Se midió la longitud en centímetros Tratamientos aplicados en la etapa de multiplicación

14 Numero de entrenudos (A) Brote con 3 entrenudos (B) Brote con 4 entrenudos Niveles que determina la vigorosidad de los nuevos brotes NivelesVigorosidad 1Brote débil 2Brote resistente 3Brote firme 4Brote vigoroso AB

15 AB CD Niveles de vigorosidad (A) Brote débil (B) Brote resistente (C) Brote firme (D) Brote vigoroso.

16 Longitud de la planta tomada en centímetros Subcultivos sucesivos (A) Entrenudos obtenido después del primer subcultivo (B) y (C) Nuevos brotes generados en los subcultivos subsiguientes A BC

17 Etapa de enraizamiento TratamientoGA 3 (mg L -1 ) A11 A22 A33 Respuesta de crecimiento.- Se midió la longitud alcanzada por los brotes al cabo de dos semanas Tratamientos para alargamiento de brotes Elaboración de medios de cultivo con GA 3

18 TratamientoMedio de cultivoANA (mg L -1 )Estado R1MS0.1Sólido R2MS0.5Sólido R3MS1Sólido R4MS1.5Sólido R5B50.1Sólido R6B50.5Sólido R7B51Sólido R8B51.5Sólido Tratamientos para el establecimiento de la etapa de enraizamiento Nivel de enraizamiento.- Longitud de raíz desarrollada mediante niveles del 0 al 4 Tiempo de enraizamiento.- Tiempo que tarda en aparecer la primera raicilla en el explante. Variación de longitud de los brotes.- Longitud alcanzada por la plántula

19 Niveles de enraizamiento (A) Sin raíz (B) Raíz desarrollada al 25% (C) Raíz desarrollada al 50% (D) Raíz desarrollada al 75% (D) Raíz desarrollada al 100%. A B C D E

20 RESULTADOS Fase de desinfección Gráfico de las variables contaminación, necrosis y muerte con respecto a la interacción [NaClO] y Tiempo de inmerisón

21 Gráfico de presencia/ausencia de brotes encontrados al usar la interacción ANA y BAP en el medio de cultivo P / A de brotes vs interacción [BAP] * [ANA] Fase de inducción de brotes

22 Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA] Gráfico de longitud de los brotes con respecto a la interacción de las hormonas ANA y BAP

23 Se rechaza la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos Existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la longitud de brotes con respecto a la interacción de las hormonas ANA y BAP

24 Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA] Gráfico del número de entrenudos con respecto a la interacción de hormonas ANA y BAP

25 Rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos Existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la variable número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal ANA y BAP.

26 1º SUBCULTIVO Fase de multiplicación de brotes P / A de brotes vs [BAP] y [ANA] 2º SUBCULTIVO 3º SUBCULTIVO

27 Número de entrenudos vs [BAP] y [ANA] Gráfico del número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP 1º SUBCULTIVO2º SUBCULTIVO 3º SUBCULTIVO

28 se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos. existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP Y ANA Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para variable número de entrenudos con respecto a la interacción hormonal.

29 Longitud de los brotes vs [BAP] y [ANA] Gráfico de la longitud de brotes con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP 1º SUBCULTIVO2º SUBCULTIVO3º SUBCULTIVO

30 se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de medias de tratamientos existen diferencias estadísticamente significativas entre las combinaciones de BAP y ANA Análisis de varianza y prueba LSD Fisher para la variable longitud de brotes con respecto a la interacción hormonal de ANA y BAP.

31 Alargamiento de brotes usando ácido giberélico (GA 3 ) 1, 2 y 3 mgL -1 respuesta de crecimiento Esta fitohormona no tuvo ningún efecto sobre los brotes, es decir que no existe un efecto significativo. Fase de enraizamiento

32 Enraizamiento en medio Murashige y Skoog (M&S) Longitud de los brotes vs [ANA] Gráfico de longitud de brotes con respecto a la concentración de ANA en medio M&S

33 Nivel de enraizamiento vs [ANA] Gráfico del nivel de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA en el medio M&S.

34 Tiempo de enraizamiento vs [ANA] Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA aplicada en el medio M&S.

35 Enraizamiento en medio de cultivo B5 Longitud de los brotes vs [ANA] Gráfico de longitud de brotes con respecto a la concentración de ANA en medio B5.

36 Nivel de enraizamiento vs [ANA] Gráfico del nivel de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA en el medio B5.

37 Tiempo de enraizamiento vs [ANA] Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto a la concentración de ANA aplicada en el medio B5.

38 Enraizamiento con carbón activado Longitud de los brotes vs [ANA] Gráfica de la longitud de brotes con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

39 Nivel de enraizamiento vs [ANA] Gráfica del nivel de enraizamiento con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

40 Tiempo de enraizamiento vs [ANA] Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto al uso de carbón activado en el medio de cultivo M&S

41 Enraizamiento en medio líquido Longitud de los brotes vs [ANA] Gráfica de la longitud de brotes con respecto al uso de medio M&S líquido.

42 Gráfica del nivel de enraizamiento con respecto al uso de medio M&S líquido. Nivel de enraizamiento vs [ANA]

43 Tiempo de enraizamiento vs [ANA] Gráfica del tiempo de enraizamiento con respecto al uso de medio M&S líquido.

44 CONCLUSIONES 1.5% de hipoclorito de sodio por un tiempo de 5 minutos de inmersión permite obtener explantes libres de contaminación. El medio de cultivo sin suplemento hormonal, presentó la mayor cantidad de brotes largos y la producción de un mayor número de entrenudos La adición de brasinolida permitió un mejor desarrollo de los explantes, tanto en esa etapa como en las posteriores por la acción residual El GA 3 aplicado en la etapa previa al enraizamiento, no produjeron ningún efecto sobre el alargamiento de brotes. Baja concentración de auxina o en su defecto, la no adición de la misma, si existe endógenamente, es suficiente para la generación de raíces. El medio de cultivo B5 no es eficiente para la rizogénesis, debido a la reducción de la concentración de nitratos en su composición. El uso de carbón activado provee de un ambiente de oscuridad al medio de cultivo, aumentando en gran manera la rizogénesis

45 RECOMENDACIONES Utilizar plantas jóvenes para iniciar con los procesos in vitro ya que estos tienen una mayor capacidad de regeneración Probar la utilización de otro componente para el alargamiento de tallos en la etapa previa al enraizamiento como la zeatina o el 2-iP. Utilizar una auxina débil como el AIA o en su defecto una combinación de auxinas (IBA y ANA) en las etapas para ver su respuesta in vitro. Evaluar el comportamiento de los explantes después del tercer subcultivo y de ser necesario añadir suplemento hormonal al medio de cultivo, de manera que se mantenga su capacidad de regeneración. Realizar análisis de modelos de regresión logístico binomial y multinomial, según corresponda, para los datos obtenidos. Continuar con la investigación, analizando más especies de esta familia, ya que este trabajo constituye una premisa para posteriormente crear bancos de germoplasma, estudios de genética poblacional etc.

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