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ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Previa a la obtención de Grado Académico o Título de:

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Presentación del tema: "ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Previa a la obtención de Grado Académico o Título de:"— Transcripción de la presentación:

1 ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA ORFA HIPATIA CRIOLLO FIGUEROA Directora: M. Sc. Mónica Jadán Codirector: Ing. Marco Taipe

2 Familia Agavaceae Fibras duras Economía "verde Cabuya blanca (Furcraea andina Trel.) Cabuya azul (Agave americana L.) Ecuador La exportación de cabuya en el Ecuador fue de USD 144 mil y 17,39 toneladas en el 2008 (CORPEI, 2009).

3 Falta de asesoramiento (FAO, 1994) y de desarrollo de biotecnologías. Crecimiento lento y reproducción sexual limitada (Domínguez et al., 2008). La propagación convencional no permite producción a gran escala (González et al., 2004). Propagación in vitro: Mayor número de plantas en menor tiempo. Plantaciones uniformes. Plantas libres de microorganismos. No metodología establecida para la propagación in vitro de cabuya azul y cabuya blanca.

4 General Establecer un protocolo para la propagación intensiva in vitro de cabuya azul (A. americana L.) y cabuya blanca (F. andina Trel.). Específicos Evaluar protocolos para la desinfección de explantes de cabuya azul y cabuya blanca. Evaluar reguladores de crecimiento a diferentes concentraciones que permita obtener la mayor tasa de multiplicación in vitro de cabuya azul y cabuya blanca. Evaluar medios para el enraizamiento de cabuya azul y cabuya blanca. Realizar un análisis económico y plan de producción in vitro de cabuya azul y cabuya blanca según los protocolos seleccionados.

5 Cabuya azul (Agave americana) Hierba perenne de grandes rosetas acaules. Periodo de vegetación hasta la floración (8-10 años). Producen inflorescencia una sola vez. Hierba perenne de grandes rosetas acaules. Periodo de vegetación hasta la floración (8-10 años). Producen inflorescencia una sola vez. (AA. VV., 2006; Correa y Bernal, 1989; Gupta, 1995, Paredes, 1959) Inflorescencia Fruto Hojas 15 m Reproducción Sexual: semilla. Vegetativa: rizomas. Flor Según White es nativa del Ecuador, para Howard es originaria de México.

6 Hierba perenne, xerófita y acaulescente. Cabuya blanca (Furcraea andina) (Correa y Bernal, 1989; León, 1987) Inflorescencia Hojas 1,0 a 1,8 m 10 a 15 cm Flor Reproducción: Sexual: semilla. Vegetativa: bulbillos Bulbillos Según Jorgensen & León (1999) es nativa de la zona Andina.

7 Grupo de técnicas que estudia el crecimiento de células, tejidos u órganos de plantas (explante) en un medio artificial aséptico. Medio de Cultivo (George et al., 2008; Roca y Mroginski, 1991; Abdelnour y Escalant,; Trigiano & Gray, 2005) Cultivo in vitro de tejidos vegetales Macro y micro nutrientes Reguladores de crecimiento Vitaminas Fuente de carbono Suplementos no definidos Agentes gelatinizadores 95% de agua Macro y micro nutrientes Reguladores de crecimiento Vitaminas Fuente de carbono Suplementos no definidos Agentes gelatinizadores 95% de agua AUXINAS CITOQUININAS

8 Propagación in vitro de las Agaváceas Tomado de Domínguez et al., 2008 Las citoquininas usada en especies de Agave y Furcraea es el BA y la KIN. La combinación entre BA y ANA favorece la formación de brotes. Las citoquininas usada en especies de Agave y Furcraea es el BA y la KIN. La combinación entre BA y ANA favorece la formación de brotes. (Salazar et al., 2009; Ramírez, 2008; Silos et al., 2007; Martínez y Pacheco, 2006; Vargas y García, 1996; Domínguez et al., 2008) MULTIPLICACIÓN En medio basal con auxinas como: el AIA y el IBA, ó en ausencia de RC. ENRAIZAMIENTO Explante: yemas adventicias y axilares, semillas, secciones de tallo, ápices de rizomas, ápices caulinares. ESTABLECIMIENTO Tomado de Martínez y Pacheco, 2006

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10 Se realizó en el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Departamento Nacional de Biotecnología de la Estación Experimental Santa Catalina, del INIAP. Recolectado en los predios de la empresa UYAMA FARM, ubicados en el cantón Mira al suroeste de la provincia del Carchi. Material vegetal Investigación

11 Cabuya azul Cabuya blanca Material vegetal: plantas en crecimiento sanas, de aprox. 70 a 100 cm de longitud. Material vegetal: rizomas (aprox. 1 año de edad) de 20 cm a 40 cm de alto.

12 4 a 6 cm largo Pre-tratamiento Agua corriente 2gL -1 detergente NaClO al 0,077% 16 horas Explante 1 t1: Aureoles et al. (2008) t2: Blanco et al. (2004) t3: Martínez et al. (2006) Tratamiento evaluados Ápice caulinar 1,5 a 2,0 cm Sales M&S enriquecido con: 80 mgL -1 de sulfato de adenina, 0,40 mgL -1 de tiamina, 100 mgL -1 de myo-inositol, 0,7% (p/v) de agar, 3% (p/v) de azúcar y 5% (v/v) de agua de coco (AC). Medio basal modificado (MBM) descrito por Aureoles et al. (2008)

13 Tratamientos de desinfección T1: Protocolo modificado de Aureoles et al. (2008) Agua, jabón, Tween 20 y agua estéril. 3 min en alcohol al 70%. Hipoclorito de sodio al 10% por 5 min Solución antioxidante por 5 min. Enjuague 3 veces en agua estéril. Agua, jabón, Tween 20 y agua estéril. 3 min en alcohol al 70%. Hipoclorito de sodio al 10% por 5 min Solución antioxidante por 5 min. Enjuague 3 veces en agua estéril. Agua destilada estéril y Tween 20 por 10 min Alcohol al 70% por 1 min Hipoclorito de calcio al 5% por 25 min Enjuague 4 veces con agua estéril Agua destilada estéril y Tween 20 por 10 min Alcohol al 70% por 1 min Hipoclorito de calcio al 5% por 25 min Enjuague 4 veces con agua estéril dentro de una cámara de flujo laminar. Se realizó agitación constante en todos los pasos del protocolo. T3: Protocolo de Martínez et al. (2006) T2: Protocolo modificado de Blanco et al. (2004) Solución de ácido ascórbico (100mgL -1 ) por 30 min. Solución Bactericida y fungicida por 30 min. Etanol al 70% por 1 min. NaOCl al 2% + Tween 20 + ácido ascórbico (100mgL -1 ), por 20 min. 3 lavados con agua destilada estéril. Solución de ácido ascórbico (100mgL -1 ) por 30 min. Solución Bactericida y fungicida por 30 min. Etanol al 70% por 1 min. NaOCl al 2% + Tween 20 + ácido ascórbico (100mgL -1 ), por 20 min. 3 lavados con agua destilada estéril.

14 Estadística aplicada Se evaluó a los 15 y 30 días Observaciones: 10 por tratamiento Variables: Explantes contaminados Explantes vivos Análisis: Discretas binarias Tablas de porcentaje Gráficos demostrativos Unidad experimental 5,5 cm 6,7 cm Ápice caulinar

15 Inducción de los explantes Multiplicación in vitro Medio basal modificado (MBM) descrito por Aureoles et al. (2008) suplementado con 2 mgL -1 de benciladenina (BA) y 0,1 mgL -1 de ácido indolacético (AIA), sugerido por Benítez.. Tiempo de inducción: 30 a 32 días aproximadamente E. inducido 1,5 cm a 2,0 cm Incubación: 6 semanas. Unidad experimental 5,6 cm 9,0 cm

16 Estadística aplicada DCA con 9 tratamientos Observaciones: 5 en A. americana y 6 en F. andina. Variables: Explantes regenerados Explantes con brotes Número de brotes por explante: Tamaño promedio de brotes (mm) Análisis: Discretas binarias: tablas de proporción, prueba X 2, análisis de correspondencia. Cuantitativas: ADEVA, Tukey al 5%, tablas de medias. Gráficos demostrativo s Trat. AUXINA mg L -1 CITOQUININA mg L -1 ANABAKIN T10,51- T20,53- T311- T413- T50,5-1 T60,5-3 T71-1 T81-3 T9--- Tratamientos: Evaluación a la sexta semana.

17 Individualización de brotes de cabuya para enraizamiento Longitud de brotes Cabuya azul : 3,1 cm a 12,7 cm Cabuya blanca: 3,1cm a 6,1cm Los brotes de cabuya se incubaron por 30 días. Unidad experimental 15 cm 1,5 cm Brote cabuya

18 Estadística aplicada DCA con 3 tratamientos. Observaciones: 10 en F. andina y diferente nro. de observaciones en A. americana. Variables: Plántulas con emisión de raíces Longitud de raíz (mm) Número de raíces Análisis Discretas binarias: tablas de proporción, prueba X 2. Cuantitativas: ADEVA, Tukey al 5%, tablas de medias. Gráficos demostrativos Evaluación: 15 y 30 días Tratamientos: Trat.AUXINA E1--- E211,42 uM de AIA E32,46 uM de IBA

19 Medio de cultivo Incubación Temperatura: 28±2°C (Salazar et al., 2009). Fotoperiodo: 16 h de luz y 8 h de oscuridad (Aureoles et al., 2007). pH se ajustó a 5,7± 0,1 (Aureoles et al., 2007). Esterilización en autoclave a 121,5°C y 15 lb de presión por 20 min (Roca y Mroginski, 1991).

20 Factores a definir para un plan de producción in vitro Costeo por procesos. Costos de materiales directos, equipos, utensilios, suministros y mano de obra directa. Protocolos más eficientes.

21 100

22 Explantes contaminados Pruebas preliminares : 25,0 a 92,3% de contaminación Pre-tratamiento 0% Microorganismos endógenos 0% Antibióticos y fungicidas: costosos

23 Explantes vivos Cabuya blanca (30 d) 100% de sobrevivencia en ambas cabuyas

24 Cabuya azul Explantes regenerados 100% de regeneración Callosidades: T5 (1 mgL -1 KIN - 0,5 mgL -1 ANA) T7 (1 mgL -1 de KIN - 1 mgL -1 ANA) Presencia de raíz: T5 T6 T7 T8 T9 KIN (1-3 mgL -1 ) y ANA (0,5-1mgL -1 ) Sin RC A. inaequidens Koch desarrolló raíces con KIN (3 y 10mgL -1 ) (Aureoles et al., 2008)

25 Cabuya azul Explantes con brotes La presencia de los brotes si depende del factor medio de multiplicación (X 2, p<0,0001). Análisis de correspondencia múltiple T1, T2 y T4 100% de explantes con brotes Mayor proporción de BA:ANA

26 Cabuya azul Número de brotes ADEVA: p<0,0001 Los mejores tratamientos de proliferación son: T4, T2 y T1. Prueba tukey al 5% a a b a bc bc c c c cc BA - ANAKIN - ANA Explante en T4, 5ta semana

27 Cabuya azul Tamaño promedio de brotes (mm) T1 (1 mgL -1 BA - 0,5 mgL -1 ANA) Los tamaños promedios de los brotes son estadísticamente iguales en los 6 tratamientos (p=0,3003). Las auxinas disminuye el efecto inhibitorio de las citoquininas en la elongación de los brotes (Trigiano & Gray, 2005)

28 Cabuya blanca Explantes regenerados Explantes con brotes 100% de regeneración 33,3% 16,7% Concentración endógenas de reguladores de crecimiento de cada planta (Salazar et al., 2009) Chi-cuadrado: (p=0,1224).

29 Cabuya blanca Número de brotes El número de brotes por explante en los 9 tratamientos de multiplicación muestran diferencia no significativa (p=0,117). La baja proliferación de brotes - Niveles endógenos de RC. - Tiempo - Niveles endógenos de RC. - Tiempo

30 Cabuya azul Presencia de raíz 90,91 60,0 Chi-cuadrado: a los 15 (p=0,8747) y 30 días de incubación (p=0,7319). Porcentaje de enraizamiento a los 30 días 80,0% a 90,91% E1: M&S al 100% en ausencia de RC.

31 Cabuya azul Número de raíces El promedio del número de raíces es estadísticamente igual en los 3 tratamientos evaluados, a los 15 (p=0,2551) y 30 días (p=0,7189). E2 (AIA) E1 (Sin RC) Producción de auxinas endógenas

32 Cabuya azul Tamaño de raíz (mm) La media del tamaño de la raíz es igual estadísticamente en los 3 tratamientos evaluados, a los quince (p=0,1607) y treinta días (p=0,6252). E3 (IBA) E1 (Sin RC)

33 Cabuya blanca Presencia de raíz 80% de enraizamiento a los 15 días, y 100% a los 30 días de cultivo. 90% a 100% de enraizamiento en F. macrophylla (Martínez y Pacheco, 2006)

34 Cabuya blanca Número de raíces No hay diferencia significativa a los quince (p=0,1548) y treinta días (p=0,1351). E3: IBA (0,5mgL-1) Tamaño de raíz (mm) No diferencia significativa, a los quince (p=0,2504) y treinta días (p=0,5161).

35 Cabuya azul Cabuya blanca COSTO DE PRODUCCIÓN(USD) Insumos directos3550,13 Maquinaria y equipos815,83 Materiales de laboratorio1109,30 Suministros1058,52 Personal3886,20 Suman10419,98 Valor total del costo de producción 10419,98 Imprevistos (5%) 521,00 COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN 10940,98 Costo unitario de la planta in vitro de cabuya azul enraizada 0,27 dólares COSTO DE PRODUCCIÓN(USD) Insumos directos 1737,57 Maquinaria y equipos 619,30 Materiales de laboratorio 709,30 Suministros 1016,41 Personal 3886,20 Suman 7968,78 Valor total del costo de producción 7968,78 Imprevistos (5%) 398,44 COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN 8367,22 Costo unitario de la planta in vitro de cabuya blanca enraizada 0,64 dólares

36 Cabuya azul Semanas Propágulos establecidos Nro de frascos Plantas no contaminadas (90%) Plantas a liberar Plantas enraizadas (91%) Plantas a multiplicar TM Número de propágulos explantes Cabuya blanca Semanas Propágulos establecidos Nro de frascos Plantas no contaminadas (90%) Plantas a liberar Plantas enraizadas (100%) Plantas a multiplicar TM Número de propágulos , , , , , ,52000

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38 El éxito en la desinfección en cabuya blanca y cabuya azul estuvo dada por la implementación del pre-tratamiento, donde se obtuvo un rango de contaminación de 0 a 20%. Los mejores tratamientos de desinfección para cabuya azul, que alcanzaron 0% de contaminación y 100% de explantes vivos, fueron los descritos por Aureoles et al. (2008) y Martínez et al. (2006). El mejor tratamiento de desinfección para cabuya blanca, que obtuvo 0% de contaminación, 100% de explantes vivos y sin la utilización de antibióticos, fue el descrito Martínez et al. (2006).

39 En cabuya azul los mejores tratamientos de proliferación de brotes, con diferencia significativa (p<0,0001), fueron T1, T2 y T4. En cabuya blanca los nueve tratamientos de multiplicación analizados no resultaron favorables para la propagación de esta especie a gran escala. La inducción a la formación y crecimiento de raíces en cabuya azul estuvo favorecida en medio con sales M&S, suplementado con vitaminas y agua de coco, en ausencia de reguladores de crecimiento.

40 Basado en la disminución de costos y la facilidad de enraizamiento de cabuya blanca, el mejor tratamiento de enraizamiento es el medio compuesto de sales M&S, suplementado vitaminas y agua de coco. El precio de una planta de cabuya azul enraizada a escala piloto, obtenido mediante la estimación de los costos directos de producción basados en la capacidad operacional del Laboratorio de Cultivos de Tejidos (INIAP), es de 0,27 dólares. El bajo rendimiento anual teórico en cabuya blanca dado por una baja tasa de multiplicación, incrementa los costo de producción, donde el precio de una planta enraizada a escala piloto es de 0,64 dólares.

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42 Se recomienda probar en cabuya blanca menor tiempo de exposición al pre-tratamiento, como también ensayar concentraciones menores a 0,077% de hipoclorito de sodio. En cabuya blanca se recomienda probar concentraciones mayores a 3 mgL -1 de BA en la etapa de multiplicación. Se recomienda realizar estudios para la obtención y conservación germoplasma de las cabuyas, Agave americana L. y Furcraea andina Trel.

43 Cabuya blancaCabuya azul Empresa UYAMA FARM


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