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Trabajo experimental Callogénesis en zanahoria Reguladores de crecimiento AF-5402 Arabela Vega Aguilar Noviembre 2011.

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Presentación del tema: "Trabajo experimental Callogénesis en zanahoria Reguladores de crecimiento AF-5402 Arabela Vega Aguilar Noviembre 2011."— Transcripción de la presentación:

1 Trabajo experimental Callogénesis en zanahoria Reguladores de crecimiento AF-5402 Arabela Vega Aguilar Noviembre 2011

2 Introducción George et al (2008) definen un cultivo de callos (o bien cultivo de tejidos) como el crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas.

3 ¿por qué zanahoria? Stewart y Reinert en 1958 descubrieron embriogénesis somática a partir de tejido de zanahoria. Establecida como sistema modelo. Fenómeno reportado en más de 300 especies. Demuestra totipotencia de plantas superiores.

4 Objetivo general Estudiar el rol de dos diferentes auxinas en el establecimiento de cultivos de callos de zanahoria (Daucus carota).

5 Materiales y métodos (dos protocolos distintos) Laboratorio de Biotecnología del CIA Piezas de tejido de la raíz de zanahoria. Medio de cultivo sólido. Murashige y Skoog (MS) 2 reguladores de crecimiento. AIA y 2,4 D

6 Tejido vegetal: proceso de desinfección 1.Zanahorias de 20cm de longitud y 4cm de diámetro. 2.Lavar con agua y jabón en recipiente agitando. 3.Pelar eliminando 2mm de tejido. 4.Cortar rebanadas de 1 cm de grueso. 5.Sumergir en etanol al 70% por 30 seg. 6.Sumergir en NaClO al 10% por 10 min en agitación. 7.Inicio de trabajo en cámara de flujo laminar. 8.Lavar rebanadas 5 veces con agua destilada y estéril, agitando en Erlenmeyer por 30 seg. Mc Donald et al (1995)

7 Regulador de crecimiento AIA Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 1000ppm. 2,4 D Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 500ppm.

8 Protocolo 1 MS con 1,0 ppm de 2,4D o 1,0 ppm de AIA. 25ml de medio por frasco. Cubos de tejido del cambium de 1cm. 1 cubo de tejido por frasco. 10 repeticiones por tratamiento. Cada frasco fue pesado y etiquetado. Peso de explantes por diferencia. Mc Donald et al (1995)

9 Protocolo 2 MS complementado con: 1ppm de 2,4D, 2ppm de 2,4D, 1ppm de AIA y 2ppm de AIA Capa uniforme y delgada de MS. Cortes región cambial, floema sec. 4 cortes por placa. 10 repeticiones por tratamiento. Cada placa fue pesada y etiquetada. Peso de explantes por diferencia. Placas con AIA en oscuridad. 4x PhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003)

10 Cultivo de callos (ambos protocolos) 16 horas de luz por 8 horas de oscuridad, 28 °C observaciones cada 3 días, descarte de frascos contaminados, tiempo de aparición de los callos y peso semanalmente

11 Protocolo 1 Aparición de callos 21 días después. Muchos descartes por contaminación. Cambio de balanza, posible fuente de error. Disminución en peso en todos los explantes. Aparición de tejido nuevo y coloraciones verdes, café y moradas. Desarrollo de raíz. Resultados y discusión

12 deshidratación Contaminación Inicios de raíz AIA 2,4D

13 21 días de cultivo protocolo 1 2,4 D AIA

14 29 días en AIA Fotoprotección

15 29 días en 2,4D

16 62 días de cultivo en AIA Estrés y antocianinas

17 Raíces en AIA

18 Semana 1 ningún cambio. Explantes con mayor superficie expuesta. Mala gelificación del medio. Presencia de azúcar: mayor contaminación. No representativo para curva de crecimiento. Muerte de tejido por desinfección. 41 días de cultivo: presencia de callo Resultados y discusión Protocolo 2

19 7 días en 2,4D Tejido muerto Contaminación

20 41 días de cultivo Contaminación Cambio de pigmentación

21 Conclusiones y recomendaciones Reducir tiempo y concentraciones de desinfección. Definir tipo de callo (E o NE). Definir material de origen. Jiménez y Bangerth (2001) sugieren hipocótilos Narayan y Venkataraman (2000) sugieren plántulas Comparar tipos de corte para explante en iguales condiciones.

22 Escoger recipiente más adecuado. Evaluar concentraciones y efecto del RC. Oscuridad evita degradación de AIA. Mejorar procedimiento de pesaje. Peso seco. Mayor número de repeticiones. Conclusiones y recomendaciones

23 Mi protocolo Utilizar hipocótilos como tejido de origen. Desinfección con etanol no más de 1min. Desinfección con NaClO al 3% máximo. Placas de Petri. 2,4 D a 1ppm y 2ppm, AIA a 1ppm y 2ppm Mejor manejo del medio de cultivo.

24 6 explantes muy pequeños por placa. Cuarto oscuro. Pesaje directo dentro de cámara. Observaciones y peso semanal. Expresar datos como % de ganancia de peso por explante, no curva de crecimiento.

25 Otro protocolo para zanahoria Arroz CIBCM

26 GRACIAS


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