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REGENERACIÓN Y CONSERVACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRECIMIENTO MÍNIMO DE Lupinus mutabilis (CHOCHO ANDINO) IN VITRO Alejandra Daniela Proaño Barahona 1.

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1 REGENERACIÓN Y CONSERVACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRECIMIENTO MÍNIMO DE Lupinus mutabilis (CHOCHO ANDINO) IN VITRO Alejandra Daniela Proaño Barahona 1

2 La búsqueda por una seguridad alimentaria sostenible ha creado interrogantes en la multiplicación y cultivo de los principales pilares alimenticios del mundo. Los granos constituyen la base fundamental de la alimentación y economía. Es por ello que se ha masificado el estudio de todo tipo de parámetros de crecimiento y conservación de estos alimentos. Introducción 2

3 La utilización de diferentes dosis de hormonas en procesos in vitro es la clave para mantener con éxito un cultivo asegurando, además, su regeneración y viabilidad genética. En el Ecuador, la información acerca de la regeneración y conservación de chocho es muy escasa. La necesidad de establecer e investigar dichos procesos deriva en la necesidad de todo investigador agrícola para asegurar el futuro alimenticio de América Latina y el mundo. Introducción 3

4 OBJETIVOS 4

5 Desarrollar protocolos in vitro para la regeneración y conservación mediante la técnica de crecimiento mínimo de L. mutabilis (chocho andino). General Específicos Desarrollar un protocolo de introducción, multiplicación y enraizamiento a partir de brotes axilares de chocho colectados en campo. Estudiar el comportamiento de brotes de L. mutabilis en cinco filiales de multiplicación y la fase de enraizamiento para obtener regenerantes completos. Establecer un protocolo de conservación para la dosificación de nitrato de plata, ácido abscísico y cloruro de (2-cloroetil) trimetil amonio. Obtener semilla artificial de L. mutabilis utilizando brotes axilares de las plántulas in vitro como un método alternativo de conservación. 5

6 METODOLOGÍA 6

7 Fase de introducción, multiplicación, enraizamiento in vitro con adaptación dentro de invernadero de L. mutabilis Comportamiento de brotes de L. mutabilis en cinco filiales de multiplicación y enraizamiento in vitro: Fase de conservación utilizando diferentes dosis de inhibidores de crecimiento vegetal Obtención de semilla artificial de L. mutabilis utilizando brotes axilares de plántulas in vitro Fases 7

8 Primera Fase Recolección del material vegetal 8

9 Desinfección del material vegetal Protocolo de desinfección Agua destilada (100ml/l) Benlate (1 gr./l) Yodo (5 ml/l) Jabón líquido (10 ml/l) Agitación constante (2 min) Dos lavados en agua destilada estéril (5 min) Introducción de brotes axilares en fundas ziploc con medio nutritivo (medio MS al 100%). Esquema de desinfección 9

10 Introducción del material vegetal Esquema de introducción 10

11 Protocolo de multiplicación Multiplicación in vitro Solución MS con 50% de sus macroelementos Fe EDTA (5 ml/l) Vitaminas MS normal Sucrosa (30 gr./l) Agar (7 gr./l) BAP (0,1 ppm/l ) pH de 5,6 a 5,8 Esquema de multiplicación 11

12 Enraizamiento in vitro Protocolo de enraizamiento Solución MS con 25% de macroelementos y 50% de microelementos Mio Inositol (100 ppm/l) Acido nicotínico (1 ppm/l) Piridoxina (0,1 ppm/l) Tiamina HCl (10 ppm/l) AIA (3 ppm/l) ANA (1 ppm/l) Sucrosa (30 gr./l) Agar (7 gr./l) Carbón activado (1 gr./l) pH de 5,7 a 5,8. Enraizamiento in vitro Adaptación dentro de invernadero 12

13 Segunda Fase Protocolo de germinación Agar (9 gr./l) Acido giberélico (250 ppm/l) Etanol (2 ml/l) pH de 5,6 a 5,8 Esquema de multiplicación in vitro 13

14 Segunda Fase Enraizamiento in vitro Adaptación dentro de invernadero 14

15 Tercera Fase Protocolo de conservación in vitro Medio de multiplicación Nitrato de plata (AgNO3) Ácido abscísico (ABA) Cloruro de (2-cloroetil) trimetil amonio (CCC): 0, 5, 7,5 y 10 ppm Esquema de conservación in vitro 15

16 Tercera Fase Esquema de regeneración in vitro 16

17 Cuarta Fase Esquema de obtención de semilla artificial 17

18 Cuarta Fase Regeneración de semilla artificial Protocolo de regeneración de semilla artificial Solución MS con la mitad de sus macroelementos Fe EDTA (5 ml/l) Ácido nicotínico (5 ppm/l) Piridoxina.HCL (0,5 ppm/l) Tiamina.HCL (5 ppm/l) Glicina (2 ppm/l) Sucrosa (30 gr./l) Mio inositol (1000 ppm ) Agar (7 gr./l), pH de 7 ± 0,2. Claforam (50 mg/l) 18

19 RESULTADOS 19

20 Primera Fase Introducción in vitro de L. mutabilis Multiplicación in vitro de L. mutabilis Días 45 Días 30 Días

21 Primera Fase Crecimiento radicular in vitro de L. mutabilis Planta #25 Planta #54 Planta #62 Planta #63 Planta #100 Tamaño de explante de 15 plantas de L. mutabilis seleccionadas para enraizamiento in vitro 21

22 Primera Fase Crecimiento radicular in vitro de L. mutabilis, con adaptación dentro de invernadero (planta tardía #63) Días 82 Días

23 Segunda Fase Crecimiento vegetal in vitro Análisis de varianza para tamaño de planta y número de brotes de L. mutabilis durante cinco generaciones F.VTamaño de plantaNúmero de brotes Generación<0,0001 Cultivar0,04010,0079 Tiempo0,07930,0302 Generación * Cultivar0,99730,9466 Generación * Tiempo0,96870,9199 Cultivar * Tiempo0,00280,0038 Generación * Cultivar * Tiempo0,29860,5011 CV%30,6727,69 23

24 Segunda Fase Crecimiento vegetal in vitro Promedio (+ error estándar) de tamaño de planta y número de brotes de L. mutabilis durante el efecto de cinco generaciones GeneraciónTamaño de PlantaNúmero de Brotes 1 2,59±0,57 a 2,15±0,33 a 2 7,92±0,57 c 4,32±0,33 c 3 5,95±0,57 b 3,70±0,33 bc 4 5,55±0,57 b 3,81±0,33 bc 5 5,58±0,57 b 3,40±0,33 b CV%30,6727,69 p-valor<0,

25 Segunda Fase Promedio (+ error estándar) de tamaño de planta y número de brotes de L. mutabilis durante el efecto de la interacción Cultivar * Tiempo CultivarTiempoTamaño de PlantaNúmero de Brotes C1T1 5,33±0,35 def 3,46±0,21 ef C1T2 5,72±0,39 efg 4,04±0,23 f C1T3 7,09±0,45 g 4,41±0,27 f C2T10a0a C2T2 6,9±0,78 fg 4,14±0,46 f C2T3 4,3±0,78 de 2,26±0,46 d C3T10c0c C3T20b0b C3T3 3,76±0,78 d 2,54±0,46 de CV%30,6727,69 p-valor0,00280,0038 Crecimiento vegetal in vitro 25

26 Segunda Fase Eficiencia de multiplicación in vitro Generaciones TiempoVariedadesIIIIIIIVV Tempranas206 I-4502,67+0,33abc5,67+0,33b4,33+0,88 ab4,33+0,33a4,00+0,58a 31 I-4502,33+0,33abc5,33+1,20b6,67+1,45b5,67+0,33a4,33+0,33a 62 I-4501,33+0,88ab3,33+1,67ab3,33+1,76ab3,00+1,53a2,67+1,33a 201 I-4501,67+0,33ab4,33+0,33ab3,67+0,67ab3,00+1,53a2,67+1,33a 19 I-4501,33+0,88ab3,00+1,53ab2,33+1,20a2,67+1,33a3,00+1,53a Mod. Tardías10 I-4502,00+1,00 abc4,33+0,33ab4,67+0,88ab4,67+0,33a2,67+1,33a ,00+0,58abc5,67+0,33b3,67+0,33ab5,33+0,33a4,00+0,00a 32 I-4504,00+0,58c6,00+1,00b4,33+0,33ab5,00+0,58a3,33+1,67a 41 I-4502,00+0,58abc5,33+0,33b5,67+0,33ab5,33+0,67a5,00+0,58a 27 I-4503,00+0,58abc5,00+0,58ab2,67+1,33a a3,00+1,53a Tardías20 X1,00+0,58a4,00+2,08ab2,67+1,45a2,33+1,20a2,67+1,33a ,33+1,20abc1,67+0,88a2,33+1,20a a2,67+1,33a 20 I-4502,67+0,33 abc4,67+0,88ab4,67+0,67ab5,00+0,58a5,00+0,00a 63 I-4503,33+0,88bc5,67+0,67b6,33+0,88b4,33+2,19a3,67+1,86a 95 I-4503,00+0,00abc4,67+0,33ab4,33+0,67ab5,00+1,15a3,67+0,33a 26

27 Segunda Fase 27 Eficiencia en la multiplicación de nuevos regenerantes de plantas tempranas, moderadamente tardías y tardías de L. mutabilis, durante cinco generaciones (media geométrica ± desviación estándar)

28 Segunda Fase Crecimiento radicular in vitro Análisis de varianza para el tamaño y numero de raíces de L. mutabilis in vitro F.VTamaño de raízNúmero de raíces Generación0,09620,6257 Cultivar0,69580,8093 Tiempo0,08670,2844 Generación * Tiempo0,34790,6771 Cultivar * Tiempo0,4290,4158 CV%22,8338,65 28

29 Segunda Fase Crecimiento de regenerantes de chocho en macetas bajo condiciones de invernadero F.VTamaño de plantaNúmero de brotes Generación0,11710,0053 Cultivar0,04390,4408 Tiempo0,12380,3811 Generación * Tiempo0,04880,0801 Cultivar * Tiempo0,07150,4617 CV%5,1710,94 Análisis de varianza para el tamaño de planta y número de brotes de L. mutabilis en macetas dentro de invernadero 29

30 Tercera Fase Análisis de varianza para el tamaño de planta y número de brotes en tres plantas de chocho L. mutabilis F.VTamaño de plantaNúmero de brotes Dosis0,89430,3786 Inhibidores<0,0001 Planta0,31610,0515 Repeticiones0,85670,9638 Dosis * Inhibidores0,00010,0009 Dosis * Planta0,20890,4219 Inhibidores * Planta0,03730,4984 Dosis * Inhibidores * Planta0,46640,4433 CV%68,3969,17 30

31 Tercera Fase Efecto de la interacción Dosis * Inhibidores en el tamaño de planta y número de brotes en tres plantas de chocho L. mutabilis Dosis (ppm)InhibidoresTamaño de PlantaNúmero de Brotes 0AgNO3 1,89±0,53 bc 3,89±0,88 bcd 0ABA 1,58±0,53 c 2,67±0,88 abc 0CCC 3,71±0,53 a 6,33±0,88 de 5AgNO3 3,24±0,53 ab 4,89±0,88 cde 5ABA 1,40±0,53 c 3,56±0,88 bc 5CCC 1,61±0,53 c 2,67±0,88 abc 7,5AgNO3 3,82±0,53 a 6,33±0,88 de 7,5ABA 1,57±0,53 c 2,00±0,88 ab 7,5CCC 1,52±0,53 c 3,33±0,88 abc 10AgNO3 4,70±0,53 a 6,44±0,88 e 10ABA 1,11±0,53 c 1,89±0,88 ab 10CCC 0,78±0,53 c 0,89±0,88 a CV%68,3969,17 p-valor0,00010,

32 Tercera Fase Regeneración in vitro de las plantas conservadas Regeneración in vitro de la planta de chocho tardía #63 32

33 Tercera Fase Regeneración in vitro de las plantas conservadas Regeneración in vitro de la planta de chocho moderadamente tardía #10 33

34 Tercera Fase Regeneración in vitro de las plantas conservadas Regeneración in vitro de la planta de chocho temprana #19 34

35 Cuarta Fase Regeneración de semilla artificial de chocho L. mutabilis con 100, 50 y 25% de sales MS Análisis de regresión 100% de sales MS: 5 semillas 50% de sales MS: 4 semillas 25% de sales MS: 6 semillas 1,82 – 0,03P + 0,00026P² 0 = -0,03 + 2(0,00026)P P = 0,03/0,00052 P = 58% 35

36 CONCLUSIONES 36

37 Conclusiones El ácido giberélico a concentraciones de 250ppm, permitió un 100% de germinación de semillas de chocho, luego de 4 días. En la fase de multiplicación in vitro, el BAP a concentraciones de 0,1 ppm mostró un incremento promedio de 8,71cm en 49 plantas de chocho, a los 45 días. La planta in vitro tardía #63 logró los valores más altos de tamaño de raíz con 9,1cm y 21 raíces a los 62 días cuando se usó AIA (3ppm) y ANA (1ppm). En la adaptación dentro de invernadero la misma planta logró valores positivos de 17,2cm en tamaño de planta y 15 brotes, a los 82 días. 37

38 La mayor eficiencia de multiplicación y enraizamiento in vitro de 15 plantas, se logró en la segunda generación mostrando los valores de multiplicación más altos en número de brotes y enraizamiento durante 5 filiales. El crecimiento del resto de filiales fue estable. En la fase de conservación in vitro el cloruro de (2-cloroetil) trimetil amonio (CCC) con 10 ppm, logró el mayor periodo de conservación de brotes axilares de L. mutabilis, presentando los valores más bajos para el tamaño de planta (0,78cm) y número de brotes (0,89). El porcentaje óptimo de medio Murashige Skoog para conservar embriones somáticos de L. mutabilis en semilla artificial fue de 58%, permitiendo conservarla durante, por lo menos dos meses. La mejor estabilidad de crecimiento se obtuvo a partir del lote de poblaciones tempranas de chocho. Conclusiones 38

39 RECOMENDACIONES 39

40 Se recomienda utilizar 0,1ppm de BAP para la multiplicación de L. mutabilis in vitro ya que se logra los mayores tamaños de planta. Utilizar por máximo dos generaciones de replicación de los explantes, ya que en esta filial se logran los mejores valores de eficiencia de multiplicación y enraizamiento in vitro de L. mutabilis. Se recomienda realizar estudios complementarios para probar la regeneración de L. mutabilis, considerando poblaciones tempranas. Se recomienda utilizar 10ppm de CCC para la conservación de plantas in vitro, ya que presentó los mejores resultados de almacenamiento. Recomendaciones 40

41 GRACIAS 41


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